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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
王建军, 纪冬, 成军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
王建军, 男, 吉林省人, 汉族, 1975-6-17生, 医师, 1999年毕业于第一军医大学, 获得医学学士学位, 现为军医进修学院内科传染病专业2001级硕士学位研究生, 主要从事传染病临床与病毒性肝炎的发病机理研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689 ; 军队"九、五"科技攻关项目 , No. 98D063 ; 军队回国留学人员启动基金项目 , No. 98H038 ; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目 , No. 01Q138 ; 军队"十、五"科技攻关面上项目 , No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
Abstract
目的: 应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization, SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库, 筛选并克隆双环醇调节相关基因, 阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.
方法: 以双环醇处理HepG2细胞, 同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照; 24 h后制备细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
结果: 成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库. 文库扩增后得到46个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段. 挑取含有插入片段的30个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.
结论: 应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库. 该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
Keywords: N/A