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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 757-762
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.757
乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义
董菁, 成军, 杨倩
董菁, 成军, 杨倩, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒, 基因组长度只有3.2 kb, 结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠, 因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见. 1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后, 一直沿用至今. 我们在中国流行株HBV基因序列的分析中, 在前-S1和X基因之前, 分别发现了2段编码基因序列: 前-前-S基因长度135 bp, 编码产物为45 aa; 前-X基因长度168 bp, 编码产物为56 aa. 在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列, 具有指导报告基因表达的活性. 对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例, 共31个克隆测序结果, 发现均存在前-前-S基因区. 17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/C混合型3例, 共测序45个克隆, C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60%, C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变; 而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白, 主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.

关键词: N/A
引文著录: 董菁, 成军, 杨倩. 乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 757-762
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关[1]. 全世界约有3.5亿人受到HBV感染, 危害严重, 但目前除了一小部分患者对干扰素(IFN)或核苷类似物拉米夫定的治疗有一定应答之外, 还没有特效的治疗技术和方法[2-10]. 1979年Gelibert et al首次报告了HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后, 一直沿用至今[11]. HBV基因组只有3.2 kb, 其结构特点是结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠, HBV DNA序列的利用率之高实属罕见[12-20]. 关于这一紧密DNA结构中是否存在新的编码序列, 一直没有进行系统的研究. 最近我们对于中国HBV流行株的全基因序列进行克隆和序列分析, 发现了前-前-S和前-X基因序列, 改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史[21-24].

1 乙型肝炎病毒新开放读码框架的(再)发现及其验证
1.1 前-前-S区定义

1979年, Gelibert et al首次报告了乙型肝炎病毒(HBV)基因组的全序列, 并定位了4个开放读框(ORF). 我国学者于1984年报道了大陆HBV株(adr)的序列[25]. 目前在美国国立卫生研究院(NIH)的核苷酸序列数据库(GenBank)中, 存储了200多个HBV全基因组序列, 但之后学者对4个ORF分区的界定并无异议, 沿用至今. 1995年, Gunther et al利用长距离多聚酶链反应(LA-PCR)技术, 辅以TA克隆法将患者体内的HBV基因组克隆到质粒载体中, 该方案保证了扩增片段与原模板之间的高度一致性, 又展示了模板多样性, 比Gelibert et al早先建立的研究方法操作更简便, 获得的数据更精确[26].

本研究利用LA-PCR技术扩增了中国HBV流行株DNA全基因序列, 在分析所获得的5个克隆的过程中, 在前-S1区之前发现还存在一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 命名为前-前-S区. 初期选择的GenBank中6个其他血清型的HBV克隆株进行比较, 其中3个克隆具有前-前-S区ORF. 应用DNASIS软件的蛋白质分析功能分析了前-前-S、前-S1、前-S2和S基因的完全表达产物, 前-前-S区较以往认为的大蛋白多出一个小的疏水区. 其中的19(21)个疏水氨基酸在前-前-S区形成了一个小的疏水功能域, 可能与蛋白的空间折叠或表面蛋白合成后分泌有关. 前-前-S多肽推断氨基酸序列中含有6个亮氨酸(L), 分别位于第3、9、15、19、27、39位, 前3个L是否可形成亮氨酸拉链结构, 尚需要进一步证实[21-24].

我们应用了2种方法来证实前-前-S区的真实存在. 首先是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列, 应用DNASIS软件重新确定其ORF, 结果发现甘人宝et al、Mukaide et al[27]、Okamoto et al[28]报告的HBV基因组序列中均存在前-前-S区. 其次是利用NIH网站的BLAST同源基因序列搜索软件, 将前-前-S区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索, 结果发现已经存入GenBank中的序列中, 有5个克隆的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性, GenBank注册号分别为: BAA32849、S43492、CAA25747、BAA89327和CAB38230(未发表资料, 1998年), 氨基酸残基序列同源性分别为95%、93%、93%、77%和66%. 综合上述2种方法证实的结果以及我们的资料, 可以肯定前-前-S区是实际存在的[29-35].

前-前-S区ORF最早在1983年Fujiyama et al[36]克隆的adr亚型的S基因产物中被提及, 作者认为存在一身份不明的ORF(unidentified reading frame); 而Mimms et al[37]将Fujiyama et al报告的克隆(S43492)进行再分析后, 认为该段多肽是前-S1多肽内部, 他们认为的前-S1长度为164 aa, 而不是通常认为的119 aa或108 aa.我们认为多种资料的研究结果证明前-前-S区的存在, 以往的研究认为该区的编码并不是一种普遍现象, 因而未加以重视[38-45]. 我们分析的结果提示具有前-前-S区的HBV克隆株多来自日本和中国, 欧美学者在最初的研究中获得的样本存在一定的偏差, 这可能是忽视该区域的原因之一. 另外, 由于目前仍缺乏对HBV的大规模分子流行病学资料, 因而早期发现前-前-S区的学者可能认为一些位点发生变异, 而不认为这是一种主流现象, 但我们对其他学者获得的克隆进行分析也发现了前-前-S区, 应当认为前-前-S区的存在不是一种个别现象, 至少在中国和日本是非常常见的[46-50].

总之, 在HBV前-S1 ORF之前存在有一融合编码的ORF, 我们将其命名为前-前-S区. 如前-前-S多肽的表达得到进一步证实, 将对HBV感染的检测、疫苗设计、HBV进入肝细胞机制(受体学说)、表面抗原的表达过程及功能、宿主抗感染机制、肝细胞癌产生机制研究均产生重大影响[51-55].

1.2 前-X基因定义

本研究在分析所获得的5个HBV全基因组, 在X区之前发现还存在一个ORF, 长度168 bp, 编码56 aa. 以G683-A2编码的前-X多肽分析, 该多肽分子量约为6.2 kD, 有15个疏水氨基酸, 24个极性氨基酸. 应用DNASIS软件的蛋白质分析功能分析了前-X-X基因的完全表达产物, 前-X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区. 前-X区编码多肽含有5个C, 可能形成多个二硫键, 易于产生新的二级结构. 前-X多肽含有24个极性氨基酸, 形成一个亲水功能域, 可能影响到整个蛋白的空间构象. 根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析, 发现该区域含有多个S, 可能是磷酸化的重要区域, 与细胞内信号转导有关.

我们也应用了2种方法来证实前-X区的存在. 其一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列, 应用DNASIS软件重新确定其ORF, 结果发现甘人宝et al揭示的HBV基因组序列中存在前-X区ORF. 其他亚型不表达前-X区多是由于前-X区起始密码子ATG发生替换突变所致, 其他亚型的克隆表现为TTG(X04615), 或CTG(克隆X02763、Z35717和G329640). 另一adr亚型克隆D12980保留了第一起始密码子ATG, 但在两个起始密码子之间由于发生替换突变, 而终止了前-X多肽的表达. 初步推定前-X区起始密码子处发生的替换突变可能是血清型特异性的. 其二是利用NIH网站的BLAST软件, 将前-X区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索, 结果发现已经存入GenBank中的序列中, 有19个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性, 分别为来自2组报道, 其中2个克隆是来自同一序列的不同解释, 另17个克隆均来自日本学者对肝细胞癌患者体内存在的HBV基因组分析所获得的. 我们克隆的氨基酸序列与18例相关克隆的比较, 发现同源性为85%-94%. 这些克隆的共性为: 第一, 均为adr亚型; 第二, 均克隆自HCC患者. 综合上述两种方法证实的结果以及我们的资料, 可以肯定前-X区是实际存在的.

最早在1990年Loncarevic et al[56]自HCC患者血液中克隆的adr亚型的HBV基因组中提及了前-X区, 作者简单介绍了前-X区的存在; Takahashi et al[57]于1995年的研究结果认为前-X区与HCC有密切关系. 1998年, Takahashi et al自HCC患者体内克隆了40株HBV全序列, 其中38株为adr亚型, 之中的18株含有前-X基因, 作者综合以往的资料, 认为前-X基因与HCC有密切的关系. 但上述资料分析的患者病例数较少, 结论需要进一步推敲. 我们选择的患者为慢性乙型肝炎患者, 并不是HCC患者. 我们搜集的24株编码前-X基因的克隆均为adr亚型, 提示前-X区的存在可能是一种亚型特异性现象.

总之, 在HBV X基因之前存在有一融合编码的ORF, 为前-X区; 如前-X多肽的表达得到进一步证实, 将对HBV感染的检测、全X蛋白的功能、HBV的致癌机制的研究均会产生重大影响. 我们早先的研究探讨了X蛋白不同变异株的反式激活作用的强弱, 下一步将探讨前-X-X蛋白的反式激活作用.

1.3 文献的回顾性分析

本研究组在以往的研究中着重研究了HBV准种现象, 研究的结果提示HBV在慢性乙型肝炎患者体内是以准种群形式存在的. 本研究组应用新的序列分析软件, 利用GenBank中的信息资源, 对来自多家实验室的关于HBV基因组的数据进行了比较分析, 结果提示HBV存在有新的ORF.

目前在美国国立卫生院的GenBank中, 存储了200多HBV全基因组序列, 本研究初始以限定条件搜索出符合条件的HBV基因组序列共50株, 其中adr血清型28株, adw血清型22株, 经过比较发现, 28株adr血清型的病毒株总一致率为76.6%, 22株adw血清型的病毒株总一致率为73.9%, 提示近四分之一的序列位点表现为编码的多样性, 基因位点包括替换、缺失和插入突变等多种突变形式[58-62].

本课题组研究的50个病毒株中, 一共有43个克隆编码前-前-S基因, 不表达的7个克隆中5个克隆在前-前-S区起始密码子编码ATG处编码AGG, 而另2个克隆编码ATA. adr血清型28个克隆中前-前-S区的阳性率为100%, 一致率为85.2%, 高于adr血清型病毒株的总一致率76.6%; adw血清型22个克隆中前-前-S区的阳性率为98.5%, 一致率为74.8%, 与adw血清型总一致率的73.9%极为相近.

我们针对这50个病毒株的研究揭示: adr血清型28个克隆中, 25个克隆在前-X区起始密码子处编码为ATG, 前-X区起始密码子处编码为ATG的25个病毒株中, 14株自起始密码子ATG至X基因起始密码子ATG之间的区域的168 nt中无终止密码子, 提示这14个克隆均编码前-X基因, 另11株克隆发生C/A2733→T的替换突变, 导致前-X区表达被提前终止. adw血清型22个克隆中, 在前-X区起始密码子处均不表现ATG, 提示前-X区可能是adr血清型特异性的一种表现. 不表达前-X多肽的病毒株均是因为在前-X区起始密码子发生替换突变, 突变形式为A2608→C/T. 来自多个研究组的HBV病毒株基因组中均编码前-X基因, 我们认为这说明前-X基因是事实存在, 是被忽视的一段重要序列. 被忽略的主要原因在于: (1)获得的HBV基因组序列的数目尚少, 不足以展示HBV序列的多样性; (2)前-X区为adr血清型特异性现象, 在既往的研究中缺少对adr血清型HBV基因组的深入研究; (3)A2608→C/T替换突变、C/A2733→T替换突变以及上述2个位点的双替换突变导致前-X区多肽表达被终止, HBV编码的X蛋白自然自下一个ATG开始. 因此针对前-X区域的替换突变的研究仍需要进一步加强.

总之, 我们应用现有的计算机软件对GenBank中存储的50个HBV病毒株全基因组进行了深入分析, 前-前-S区的存在是较为普遍的现象, 而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点, A2608→C/T和/或C/A2733→T替换突变是导致前-X基因编码失败的主要原因. 结合上述结果, 我们修正HBV基因结构图见图1, 进一步的分子生物学和抗体流行病学研究正在进行之中[63-65].

图1
图1 HBV各ORF修正图.
2 S区和X基因启动子的重新定义
2.1 前-前-S启动子

为进一步证实上述的研究结果, 本研究组扩增前-前-S ORF中ATG上游277 bp核苷酸序列, 分析发现该序列富含TA(61%), 虽无真核生物的启动子元件TATA盒, 但发现含有TATA样盒. 以分离克隆株G387-A7为模板将该序列进行克隆, 构建含报告基因CAT的重组质粒, 瞬时转染HepG2细胞, 酶联免疫黏附法(ELISA)方法检测氯霉素乙酰化酶(CAT)表达活性, 结果发现我们界定的前-前-S-基因启动子序列能够激活下游CAT的表达, 具有启动子的活性, 与pCAT-basic相比A值均明显升高. 重复试验也得到了同样的结果. Bogomolski et al 亦发现前-S2/S启动子不含典型的TATA盒, 但有启动子活性, 可与胞核提取物特异结合. 在与SP1、SP2比较的过程中发现, 前-前-S基因与SP1部分重叠, 这与SP2和前-S1的关系相似. 前-前-S-基因启动子完全包含在SP1中, 前-前-S-基因启动子与SP1的关系如何, 二者之间是相互重叠, 还是共用启动子？还有待于进一步研究, 但可以肯定的是前-前-S-基因ORF上游的序列具有启动子活性(图2)[23].

图2
图2 pCAT3-前-前-S-p转染HepG2细胞24 h后CAT的表达. 组1: pCAT-basic; 组2: pCAT-promoter ; 组3 pCAT3-前-前-S-p.
2.2 前-X基因启动子讨论

为进一步证实前-X区的初步研究结果, 聚合酶链反应(PCR)法扩增前-X基因ORF起始密码子ATG上游225 bp核苷酸序列, 分析发现该序列含有真核生物的启动子元件TATA盒, 与XP序列比较仅有30 bp的核苷酸重叠. 以分离克隆株G387-A7为模板将该序列进行克隆, 构建含报告基因CAT的重组质粒, 瞬时转染HepG2细胞, ELISA方法检测CAT表达活性, 结果发现确有启动子活性, 与pCAT-basic、pCAT-promoter相比A值均明显升高. 重复试验也得到了同样的结果, 为研究前-X的存在提供了新的证据(图3)[24].

图3
图3 pCAT3-前-X-p转染HepG2细胞后CAT的表达. 组1: pCAT-basic; 组2: pCAT-promoter; 组3: pCAT3-前-X-p.
3 前-前-S基因和前-X基因的分子流行病学研究
3.1 前-前-S基因的分子流行病学研究

为证实前-前-S区的存在, 采用PCR-TA克隆-测序方法测定前-前-S区的编码方式, 同时以巢式PCR-多引物PCR法确定患者体内HBV基因型, 探讨基因型与前-前-S区编码区之间的关系, 结果发现15例患者中, 基因型C型9例, B型1例, B/C混合型5例; 共31个克隆测序结果, 均编码前-前-S区, 编码区长度135 bp, 编码45 aa. 见图4.

图4
图4 前-前-S区编码基因及蛋白质序列.

结果证实: 1. 前-前-S区编码是一种普遍现象; 2. 前-前-S区编码与HBV基因型无关.

3.2 前-X基因的分子流行病学研究

为证实前-X区的存在, 采用PCR-TA克隆-测序方法测定前-X区的编码方式, 同时以巢式PCR-多引物PCR法确定患者体内HBV基因型, 探讨基因型与前-X区编码区之间的关系, 结果发现: 17例患者中, A型1例, B型3例, C型10例, B/C混合型3例; 共测序45个克隆, 其中发生A2608→C/T替换突变者15例, 发生C/A2733→T替换突变者13例, 发生双突变10例, 见表1.

表1 前-X区编码突变在HBV基因型中的分布.
A2608→C/T替换突变C/A2733→T替换突变双替换突变编码前-X区
A型0010
B型0062
C型53018
B/C0037
比例%11.16.722.260

上述结果证明: 1. C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的66.7%, 近年来的研究表明HBV C基因型是中国大陆地区主要流行基因型, 因此推断前-X区编码现象在中国HBV感染者中较为普遍, 这同时提示前-X区的编码具有一定的基因型特异性; 2. C型编码前-X区发生突变而终止前-X表达的原因主要以A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单突变形式为主, 而B型、B/C型主要因为双突变的发生而导致了前-X区不编码蛋白(图5).

图5
图5 前-X区编码基因及蛋白质序列.

总之, 我们通过针对文献的再分析和分子生物学方法证实了前-前-S区和前-X区的实际存在, 并重新确定了S区启动子和X启动子的位置, 提出全S基因和全X基因在HBV基因组中的新位置, 可能对HBV生活史、病毒受体、肝细胞的癌变等研究提出新的思路[66-68].

编辑: N/A

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