基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 676-679
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.676
实验性大鼠肝纤维化TGFβ1及其受体mRNA 与Smad3, 7的表达
宋仕玲, 龚作炯, 张全荣
宋仕玲, 龚作炯, 张全荣, 武汉大学人民医院感染科 湖北省武汉市 430060
龚作炯, 男, 1962-12-01生, 湖北云梦人, 汉族, 1987年武汉大学医学院硕士研究生, 1996年比利时鲁汶大学医学院博士研究生毕业, 1996-1998年比利时鲁汶大学医学院博士后, 现任武汉大学人民医院感染科主任, 教授, 博士生导师. 主要从事病毒性肝炎的基础与临床研究.
通讯作者: 龚作炯, 430060,湖北省武汉市, 武汉大学人民医院感染科. zjgong@163.com
电话: 027-88041911-8385 传真: 027-88042922
收稿日期: 2003-09-06
修回日期: 2003-10-25
接受日期: 2003-11-19
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 研究四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化大鼠肝脏转化生长因子β1(TGFβ1)及其Ⅰ, Ⅱ型受体(TGFR)、Smad3、Smad7的定位及表达.

方法: 将24只大鼠随机分为正常对照组与模型组, 模型组大鼠予以40%四氯化碳皮下注射8 wk后处死. RT-PCR检测肝组织TGFβ1, TGFRⅠ与TGFRⅡ; 免疫组化技术检测TGFβ1, Smad3, Smad7在肝脏的表达及细胞内的定位; 放射免疫方法检测透明质酸, 肝组织病理检查.

结果: 与正常组大鼠比较, RT-PCR显示模型组大鼠肝内TGFβ1、TGFRⅠ与TGFRⅡ mRNA表达明显增高; 免疫组化结果显示TGFβ1与Smad3 表达增加, 而Smad7的表达降低, TGFβ1与Smad3的免疫阳性反应信号主要位于纤维间隔中的细胞质, Smad7主要在肝细胞质表达(正常组与模型组大鼠TGFβ1、Smad、Smad7平均光度分别0.61±0.33与1.57±0.53, 0.248±0.042与0.785±0.904, 4.674±1.143与0.470±0.097, P<0.05; 模型组大鼠血清透明质酸水平明显增高(正常组大鼠78.4±19.2 g/L, 模型组263.2±107.0 g/L, P<0.01), 肝组织HE染色支持肝纤维化改变.

结论: 肝内TGFβ1, TGFRⅠ, TGFRⅡ, Smad3表达增强, Smad7表达减弱, 提示TGFβ1及其受体与Smad信号通道蛋白参与了肝纤维化的发生发展, 可作为防治肝纤维化发生发展的新途径之一.

关键词: N/A
引文著录: 宋仕玲, 龚作炯, 张全荣. 实验性大鼠肝纤维化TGFβ1及其受体mRNA 与Smad3, 7的表达. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 676-679
Expression of TGFβ1 and its receptors, Smad3 andSmad7 in rats with experimental liver fibrosis
Shi-Ling Song, Zuo-Jiong Gong, Quan-Rong Zhang
Shi-Ling Song, Zuo-Jiong Gong, Quan-Rong Zhang, Department of Infectious Diseases, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Correspondence to: Dr. Zuo-Jiong Gong, Department of Infectious Diseases, Renmin Hospital, WuHan University, WuHan 430060, Hubei Province, China. zjgong@163.com
Received: September 6, 2003
Revised: October 25, 2003
Accepted: November 19, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: To investigate the expression of TGFβ1, TGFRⅠ,TGFR Ⅱ, Smad3, Smad7 in fibrotic liver induced by the exposure of carbon tetrachloride (CCl4) in rats.

METHODS: A total of 24 Wistar rats were randomly allocated into two study groups: normal group and model group-CCl4 rats. The latter group was administered with CCl4 solution to induce liver fibrosis. All the rats were killed after 8 wks. The level of TGFβ1, TGFR Ⅰand TGFRⅡmRNA were examined by RT-PCR. The expression of TGF-1, Smad3 and Smad7 were detected by immunohistochemical staining in liver tissue. The serum hyalauronic acid (HA) and the liver histopathology were also examined by RIA and HE staining respectively.

RESULTS: In comparison with the normal group, TGFβ1, TGFR Ⅰ and TGFRⅡmRNA were significantly increased in model rats, the expression of TGF-1 and Smad3 was increased and the expression of Smad7 was decreased in livers of the model group (TGF-1, Smad3 and Smad7 in normal and model group were 0.61±0.33 vs 1.57±0.53, 0.248±0.042 vs 0.785±0.904, 4.674±1.143 vs 0.470±0.097 respectively, P < 0.05). The content of serum HA was increased in model rats (HA in normal and model group was(78.4±19.2 g/L) vs (263.2±107.0) g/L, P < 0.01). The histological changes of fibrosis were also remarkable.

CONCLUSION: TGFβ1/TGF receptors /Smad signaling involve the formation and development of liver fibrosis. The TGFβ1 /Smad signal pathway plays key roles in liver fibrogensis. It may be a new pathway for the treatment of liver fibrosis.

Key Words: N/A
0 引言

转化生长因子1(transforming growth factor 1, TGF-1)是致肝纤维化的最重要的细胞因子[1-5], 具有促进肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成与沉积作用[6-8]. TGF-1通过其Ⅰ, Ⅱ型受体(transforming growth factor receptor, TR)以及细胞内Smad信号通道蛋白发挥作用, 以四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化, 并观察TGF-1及其受体和胞内Smad信号通道蛋白的变化, 探讨TGF-1及其受体与信号通道蛋白Smad之间的相互关系以及各自在肝纤维化中的可能作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

CCl4分析纯购自武汉亚法生物技术有限公司, 以食用色拉油配制成400 mL/L溶液; Catrimox-14TM RNA提取试剂盒, Random primer, Ribonaclease inhibitor, Reverse transcriptase(AMV), Taq DNA多聚酶, Marker等均为Takara公司产品; Genbank检索引物序列, 委托大连Takara公司合成(表1). 抗TGF-1mAb购自北京中山生物技术有限公司; 抗Smad3, 抗Smad7多克隆抗体购自美国Santa Cruza公司; 链霉素抗生物素蛋白－过氧化酶免疫染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司; 透明质酸(hyaluronic acid, HA)试剂盒购自上海海军医学研究所. 清洁级Wistar大鼠24只, 由武汉大学人民医院实验动物中心提供, 质量200±20 g, 雌雄各半. CCl4肝纤维化大鼠模型制作参照Wang et al[1]方法略加改进. 大鼠随机分为2组: A组为正常对照组12只, B组为肝纤维化模型组12只. A组予以生理盐水3 mL/kg sc, B组按3 mL/kg sc 400 mL/L CCl4, 2次/wk. 所有大鼠于第8 wk处死, 处死前称体重. 摘眼球采血, 分离血清-20 ℃冰箱保存. 断颈椎, 剖腹取1 cm×1 cm×1 cm肝左叶组织1块10%中性甲醛固定, 其余肝左叶组织-70 ℃冰箱保存.

表1 TGF-1, TGFRⅠ, TGFRⅡ和 Smad7引物序列.
名称引物序列扩增长度(bp)
TGFβ1正义序列5'-CACCATCCATGACATGAACC-3'404
反义序列5'-TCATGTTGGACAACTGCTCC-3'
TGF receptor I正义序列5'-ATGGACTCAGCTGTGGTTGG-3'501
反义序列5'-TCAACGGATGGATCAGAAGG-3'
TGF receptor II正义序列5'-CTACAAGGCCAAGCTGAAGC-3'580
反义序列5'-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3'
GAPDH正义序列5'-TCCCTCAACATTGTCAGCAA-3'309
反义序列5'-AGCTCCACAACGGATACATT-3'
1.2 方法

大鼠肝脏TGF-1, TRⅠ与TRⅡ mRNA的RT-PCR分析 总RNA提取参照试剂盒说明书进行, 每样本取1 g 总RNA作逆转录模板合成cDNA. 循环温度与时间为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min, 54 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 共30个循环; 72 ℃ 10 min. 产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳和溴化乙腚显色, 采用HPIAS-2000型图像分析系统测定平均光度, 各指标平均光度与内参照GAPDH的比值代表其mRNA相对水平. 大鼠肝脏TGF-1, Smad3与Smad7免疫组织化学采用SP法检测, 具体操作参照说明书进行. PBS缓冲液代替一抗作阴性对照. 阳性组织呈棕色, 阴性组织呈蓝色. 在全自动图像分析系统上, 采用HPIAS-2000型图像分析软件进行定量分析, 随机选取每张切片10个视野(×400倍)测定阳性细胞占面积及平均光度, 乘积值越大表明组织中该抗原含量越多. 放射免疫分析法检测血清HA含量, 由专业人员按说明操作. 常规HE染色光镜下观察肝组织病理学改变. 肝纤维化病理学分级参照《肝纤维化诊断及诊疗评估共识》[2].

统计学处理 用SPSS统计软件(11.5版)进行统计分析, 计量资料以mean±SD表示, 并进行组间t检验. 等级资料采用R×C表资料的x2检验.

2 结果

TGF-1, TRⅠ与TRⅡmRNA的表达: 半定量分析显示, B组肝脏TGF-1、TRⅠ与TRⅡ mRNA比A组表达明显增高, 二者之间差异有显著性(P<0.05, 图1-4). TGFβ1、Smad3及Smad7的表达 A组: Smad3在正常肝细胞内几乎无表达, 在汇管区基质及间质细胞内Smad3可见少量表达, TGFβ1在上述部位以及肝窦间隙表达较明显. Smad7在肝细胞内表达十分明显, 部分肝细胞核膜也有表达, 在汇管区及Disse间隙内少量表达; B组: 大鼠肝内TGFβ1与Smad3表达明显增强, 主要见于纤维化汇管区及纤维间隔里的梭状细胞类间质细胞中, TGFβ1表达最为明显, 在近纤维间隔的肝血窦也有梭形细胞阳性着色, 但在肝细胞内无明显表达. 本组肝组织内Smad7表达极少, 阳性颗粒集中在少数肝细胞及纤维间隔内的梭状细胞内, 阳性细胞着色淡, 纤维间隔中的Smad7表达较正常组增多. 三种物质阳性表达均位于细胞质与少量胞膜. 各组阴性对照未见阳性表达, 证实免疫组化检测结果具有特异性. 半定量分析表明, B组肝内TGFβ1及Smad3含量明显高于A组, 而Smad7在A组肝内含量高于B组, 两组间分别比较差异有显著性(P<0.05, 表2). 纤维化模型组大鼠血清HA(263.2±107.0 g/L)明显高于正常对照组(78.4±19.2 g/L)(P<0.01). A组肝脏肝小叶结构正常, 肝细胞索排列规则有序, 未见变性、坏死, 肝窦与汇管区成纤维细胞少; B组正常肝小叶结构紊乱, 肝细胞索排列紊乱, 肝细胞肿胀、坏死, 可见嗜酸性小体, 间质中有炎性细胞浸润, 坏死区及汇管区纤维结缔组织增生形成细小的条索, 纤维宽窄不一, 呈星芒状向肝小叶内延伸. 肝纤维化分期: A组(全为0)与B组(2, 3, 4期分别为2, 7, 1例)之间病理学分期差异有非常显著性(P<0.01).

图1
图1 RT-PCR检测各组TGF-1和GAPDH mRNA表. 1, 3: 分别为A、B组大鼠肝组织TGF-1 mRNA; 2, 4: 分别为A、B组大鼠肝组织GAPDH mRNA.
表2 大鼠肝组织TGFβ1, Smad3, Smad7定量分析结果(mean±SD).
分组TGFβ1含量Smad3含量Smad7含量
A组0.61±0.330.248±0.0424.674±1.143
B组1.57±0.53a0.785±0.904a0.470±0.097a
aP<0.05 vs A组.
图2
图2 RT-PCR检测各组TGFRⅠ和GAPDH mRNA 表达水平. 1, 3: 分别为A、B组大鼠肝组织TGFRⅠ mRNA; 2, 4: 分别为A、B组大鼠肝组织GAPDH mRNA.
图3
图3 RT-PCR检测各组TGFRⅡ mRNA和GAPDH mRNA 表达水平. 1, 3: 分别为A、B组大鼠肝组织TGFRⅡ mRNA; 2, 4: 分别为A、B组大鼠肝组织GAPDH mRNA.
图4
图4 RT-PCR检测各组TGF-1, TRⅠ和TRⅡ mRNA的表达.
3 讨论

TGF-在肝内异常表达可导致各种肝病的发生[6], 在诱导肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)的致肝纤维化过程中作用更显著[7-9]; TGF-可抑制肝细胞再生, 诱导肝细胞凋亡[10-11]; TGF-在转录与翻译水平上促进肝脏胶原、纤维连接蛋白等合成, 同时抑制等多种水解酶的合成与分泌, 增加TIMP等蛋白酶抑制剂的表达, 具有拮抗ECM降解, 促使肝内结缔组织增多的作用[12]. TGF-1是TGF-超家族中对ECM合成与沉积失调而导致组织纤维化最重要的调节因子, 多种器官纤维化、硬化、动脉粥样硬化都与之相关[13-16]. TGF-必须活化并与其效应细胞上的受体结合才能发挥作用[17], 他首先在细胞外与TRⅢ形成复合物, 将TGF-传递给TRⅡ, 或TGF-直接与TRⅡ结合, 随后活性TRⅡ的蛋白激酶使Ⅰ型受体磷酸化, 后者直接使TGF-的信号通道蛋白Smad2、3 MH2结构域的SSXS基序磷酸化, 与Smad4形成异源寡聚体复合物, 该复合物转移到胞核调节相应靶基因转录, 在细胞水平介导TGF-的生物学效应[18-20]. 抑制型Smad6, 7是细胞中TRⅠ型受体丝氨酸/苏氨酸激酶的拮抗蛋白[3], 能牢固的与TRⅠ型受体结合, 抑制Smad2, 3磷酸化, 完全阻断TGF-的信号转导[21], 抑制活化Smad复合物在核内移动, 减少Ⅰ型胶原合成, 在TGF-信号转导中构成负反馈调节环路.

HSC与成纤维细胞内在自分泌与旁分泌的TGF不断刺激下, HSC活化并转化为MFB, 促进胶原合成增生[22], 两种细胞内TRⅠ和TRⅡ表达都明显增高[23]. 我们发现, 与正常组大鼠相比, 肝纤维化大鼠肝内TGFβ1 及其Ⅰ, Ⅱ型受体mRNA高表达, 说明CCl4具有刺激TGF分泌增加, 同时也诱导TRⅠ和TRⅡ表达的作用, TGF通过与不同受体结合发挥生理病理作用. 免疫组化结果显示, 肝纤维化大鼠肝内TGFβ1及Smad3表达明显增高, 主要分布在纤维间隔、汇管区的不规则细胞胞质内, 肝细胞内无明显表达, 表明TGF通过激活TRⅠ后, 结合Smad3等下游分子, 作用于肝脏非实质细胞, 刺激胶原合成; 也说明Smad3与TGF在纤维化肝脏的表达模式相似, 都在肝纤维化时表达上调. 研究证实[24], 活化的HSC中Ⅰ型胶原的大量表达需要Smad3参与; 同时发现在正常大鼠肝内Smad7表达明显, 主要位于肝细胞内, 说明在生理状态时, Smad7主要存在于数量众多的肝细胞内, 对维持肝脏生理平衡状态有重要意义. 有研究发现TGF-可快速诱导静止期HSC中 Smad7和α2(Ⅰ)型胶原mRNA的表达, 由HSC转化的MFB失去TGF-诱导下的Smad7表达上调敏感性, 而Smad2, 3表达有增加[22,25-26]. 我们亦发现, 与正常肝脏相比较, 纤维化肝脏的肝细胞内Smad7表达明显减少, 而在肝间质细胞内表达增多, 可能与纤维化时, 聚集在纤维组织中的活化HSC中大量分泌TGF-诱导Smad7表达有关, 故Smad7表达显著部位随着疾病出现而相应改变. 在Smad7的低水平表达时, Smad2、Smad3磷酸化作用增加, 使TGF-与TR1持续激活, 刺激HSC不断增生、合成分泌ECM, 并不断激活周围静止的HSC活化并转化为MFB, 是TGF-致肝纤维化作用的主要原因[3,27].

本研究表明, TGF-, TR1, TRⅡ及其细胞内信号分子在肝纤维化形成发展中作用显著, 可针对TGF-产生、与受体结合、以及下游Smad分子等活化的各个阶段采取相应对策, 阻断其生物和活性, 抑制HSC活化, 从而拮抗肝纤维化[28-30]. 已经有研究证实[31], 可溶性TRⅡ(soluble TGF-beta type II receptor , STR)对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型具抑制TGF-和拮抗纤维化作用, STR降低Ⅰ型胶原mRNA含量, 并具有明显的剂量依赖性. 对单侧肾小管阻塞大鼠采用转基因Smad7治疗, 可增加Smad7表达, 完全抑制Smad2, 3活性, 明显减少Ⅰ, Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达[32]. 封闭TGF-/Smad信号通路, 采用腺病毒电穿孔基因转导Smad7注射入肾纤维化大鼠体内, 免疫组化检测发现肾髓质中有明显的Smad7沉积, 并显著抑制肾纤维化发生[33]. 由于在机体多组织多细胞都有TGF-及其受体参与发挥生理作用, 长期完全阻断TGF-以治疗肝纤维化必须考虑安全性问题.

编辑: N/A

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