病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 319-322
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.319
应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究
张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清, 梁耀东, 李强, 刘敏
张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清, 梁耀东, 李强, 刘敏, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张健, 男, 北京市人, 汉族, 医师, 内科传染病学专业硕士研究生, 主要从事传染病的临床与基础研究工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15

目的: 应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 7 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus, HCV NS5ATP7)的反式调节基因.

方法: 构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: HepG2细胞经转染NS5ATP7后, 有12条差异基因表达, 其中4条基因表达增强, 8条基因表达降低.

结论: 应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因, 为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

关键词: N/A
引文著录: 张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清, 梁耀东, 李强, 刘敏. 应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 319-322
Screening and identification of human genes transactivated by NS5ATP7 by cDNA microarray assay
Jian Zhang, Yan Liu, Jun Cheng, Lin Wang, Qing Shao, Yao-Dong Liang, Qiang Li, Min Liu
Jian Zhang, Yan Liu, Jun Cheng, Lin Wang, Qing Shao, Yao-Dong Liang, Qiang Li, Min Liu, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: Grants from National Natural Science Foundation of China, No. C030114020, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No. 98H038.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: July 12, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004

AIM: To study of genes trans-regulated by human gene 7 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus (NS5ATP7) by cDNA microarray assay.

METHODS: The recombinant expression plasmid pcDNA 3.1(-)-NS5ATP7 was constructed, and HepG2 cells were transfected. Total mRNA was isolated from the HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-) and pcDNA3-NS5ATP7, respectively. Microarray was conducted for screening of up- and down-regulated genes of both HepG2 cells.

RESULTS: After transfecting HepG2 cells, we found 4 genes were up-regulated, and 8 genes down-regulated.

CONCLUSION: cDNA microarray is successfully used to screen the genes trans-regulated by NS5ATP7, which brings some new clues for studying the trans-regulated and immune regulation mechanism of NS5ATP7.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属, 是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒. 在大多数感染人群中HCV表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌, 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关[1-10]. HCV至少被分为10种结构蛋白和非结构蛋白, 其中非结构蛋白NS5A基因(位于6 258 bp-7 601 nt之间)编码的58 kD的NS5A蛋白(448 aa)具有多种生物学功能, 在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用[11-14]. 研究表明, NS5A上存在干扰素α(IFNα)敏感决定区(ISDR), 与干扰素α治疗的敏感性相关[15-16]; 此外, NS5A还是一种作用很强转录激活因子[17-21], 调控着细胞内许多病毒及细胞基因的转录, 与感染HCV的细胞发生恶性转化过程有关. 我实验室应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究, 筛选出了一系列已知及未知功能基因, 并把其中一个未知功能基因克隆化, 命名为丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 7 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus, HCV NS5ATP7)[22]. 此外, 本实验室正在对NS5ATP7进行酵母双杂交研究, 观察与之有相互作用的蛋白. 为了从不同的角度对NS5ATP7的反式调节基因进行验证及研究, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)[23-26]对NS5ATP7反式调节的靶基因成功地进行了筛选, 为今后更加广泛深入地研究NS5ATP7的反式调节基因打下了基础.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen公司); Lipo-fectamine PLUS 转染试剂(Gibco公司), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech公司), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech公司), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim公司), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega公司).

1.2 真核表达载体及细胞转染

NS5ATP7蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP7为本室构建. 用Lipofectamine PLUS 转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP7及pcDNA 3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2 细胞, 48 h后收获细胞.

1.3 细胞mRNA提取

使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了NS5ATP7表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析.

1.4 探针标记

参照Schena et al的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA (5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+0.2% SDS杂交液中.

1.5 芯片制备

包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 μg/μL溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2%的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.6 杂交及洗涤

将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 0.2% SDS、0.1%×SSC + 0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.7 检测与分析

用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 总RNA及mRNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与 -20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.2 NS5ATP7蛋白上调基因类型

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为HCV NS5ATP7蛋白的上调基因. 在本研究中发现有4种基因的表达水平上调(表1).

表1 NS5ATP7上调基因类型.
编号Cy3/Cy5比值基因名称
12.012细胞色素 P450, 亚科IIC(美芬妥英4-羟化酶), 多肽9(CYP2C9)
22.092干扰素诱导丙型肝炎相关的微管聚集物蛋白(MTAP44)
32.134钾内部矫正通道, 亚科J, 10号(KCNJ10)
42.288钾电压门通道, KQT样亚科, 3号(KCNQ3)
2.3 HCV NS5ATP7蛋白下调基因类型

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCV NS5ATP7蛋白的下调基因. 在本研究中发现有8种基因的表达水平下调(表2).

表2 NS5ATP7下调基因类型.
编号Cy3/Cy5比值基因名称
10.220小的可诱导的细胞因子A2(单核细胞趋化性蛋白1)(SCYA2)
20.227异常的人体基因图, 染色体X, dbl同功型(原癌基因)
30.294主要组织相容性复合体1-样序列(HLALS)
40.371舒血管素3(前列腺特异抗原)(KLK3)
50.416钙激活蛋白酶, 小亚单位1(CAPNS1)
60.422蛋白激酶C, α(PRKCA)
70.454叶酸盐水解酶1(前列腺特异的膜抗原)(FOLH1)
80.472前脑啡肽(PENK)
3 讨论

丙型肝炎病毒基因组的翻译是在有关酶的作用下合成一个长约3 011氨基酸的多蛋白前体, 然后在宿主信号肽酶和病毒编码的蛋白酶作用下裂解为各种蛋白, 即: 结构蛋白C、E1、E2、p7, 和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[27-32]. 其中非结构蛋白NS5A具有多种生物学功能, HCV NS5A是病毒编码的一种功能广泛的蛋白质, 参与许多重要的调节过程. HCV NS5A位于HCV多蛋白的羧基末端, 是丝氨酸磷酸化蛋白质, 依磷酸化程度的不同而产生两种不同分子量大小的多肽p56和p58, p58被认为是p56的超级磷酸化产物. 由于NS5A表现出对抗干扰素α的治疗效应而引起人们广泛的关注, NS5A能够与肝细胞中的IFNα刺激蛋白-双链RNA依赖的激酶(PKR)相互作用, 抑制PKR的功能, 从而下调IFNα刺激的抗病毒效应. 位于NS5A蛋白中央包括一段干扰素敏感决定区(ISDR), 该区被认为是介导NS5A与IFNα诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)结合的部位, 后者是IFNα诱导的早期细胞内抗病毒合成反应. 同时NS5A显示出诱导CXC趋化因子、白介素-18(IL-18), 可抵消了IFNα抗病毒效应[32-33]. 目前认为NS5A蛋白是在细胞蛋白激酶作用下发生磷酸化修饰后发挥生物调节作用的. 不同磷酸化形式的NS5A蛋白具有反式激活作用是目前关于NS5A生物学功能研究的热点. 研究发现, NS5A片段转录激活作用最强的位点定位于2 135和2 331 aa之间. NS5A的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区( 2 143-2 184, 2 220-2 273 aa)和一个脯氨酸富集区(2 282-2 327 aa). 酸性氨基酸区的酸性氨基酸残基的数量与NS5A的反式激活活性相关, 两个酸性氨基酸区是NS5A的转录激活作用的核心区域, 因此酸性氨基酸区的一些氨基酸的突变可明显影响NS5A的转录激活作用, 但是这些突变更多的是引起蛋白的二级结构的改变. Gong et al研究发现, NS5A能够反式激活核转录因子NF-κB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用. 通过反式激活作用, NS5A还可抑制细胞周期调节基因p21WAF1的表达, 抑制p53介导的对转录的反式激活作用和细胞凋亡作用[34-36].

我实验室应用SSH技术对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究, 筛选出了一系列已知及未知功能基因, 并把其中一个未知功能基因克隆化, 命名为NS5ATP7. 为进一步研究NS5ATP7的功能, 从而对NS5A的生理学功能有进一步的了解, 我们应用表达谱芯片技术对NS5ATP7的反式调节基因进行研究.

因基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到2组组织或细胞基因表达谱的差异, 故在HCV感染及其致癌机制的研究中具有重要的应用价值. 我们以HepG2细胞基因组DNA为模板, 应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的NS5ATP7基因片段, 常规分子生物学技术构建NS5ATP7的真核表达载体pcDNA3- NS5ATP7, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析. 结果表明, 细胞色素 P450、干扰素α诱导丙型肝炎相关的微管聚集物蛋白、钾电压门通道及钾内部矫正通道4种基因的表达水平上调, 主要组织相容性复合体1、钙激活蛋白酶、蛋白激酶C 及叶酸盐水解酶1等8种基因的表达水平下调. 总之, 本研究的结果表明, NS5ATP7对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 基因芯片技术是研究反式调节基因的有效技术. 他为我们进一步深入研究NS5ATP7的反式调节基因的功能打下了重要基础.

编辑: N/A

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