研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-12-15; 12(12): 2901-2904
在线出版日期: 2004-12-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i12.2901
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选
张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清
张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135, 北京市自然科学基金项目, No. 5042024
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-05-28
修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2004-12-15

目的: 应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因.

方法: 以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5, 以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: HepG2细胞经转染NS5ATP5后, 有17条基因表达增强, 12条基因表达降低.

结论: 成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因, 为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

关键词: N/A
引文著录: 张健, 刘妍, 成军, 王琳, 邵清. 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选. 世界华人消化杂志 2004; 12(12): 2901-2904
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: December 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)的感染, 不仅能够引起急慢性病毒性肝炎, 而且能够引起肝纤维化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC), 严重危害人们的生命健康. 我国目前一般人群的感染率达3.2%, 因而具有很大的危害性[1-13]. HCV至少被分为10种结构蛋白和非结构蛋白, 其中非结构蛋白NS5A基因(位于6258-7601 nt之间)编码的Mr 58 000的NS5A蛋白(448 aa)具有多种生物学功能, 在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用[14-17]. 研究表明, NS5A是一种作用很强转录激活因子[18-22], 调控着细胞内许多病毒及细胞基因的转录, 与感染HCV的细胞发生恶性转化过程有关. 我实验室应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究, 筛选出了一系列已知及未知功能基因, 并将其中一个未知功能基因克隆, 命名为丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus, HCV NS5ATP5)[23]. 此外, 我实验室已经对NS5ATP5进行酵母双杂交研究, 观察了他与白细胞之间有相互作用的蛋白[24]. 为了从不同的角度对NS5ATP5的反式调节基因进行验证及研究, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)对NS5ATP5反式调节的靶基因成功地进行了筛选, 为今后更加广泛深入地研究NS5ATP5的反式调节基因打下了基础.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen公司); Lipofectamine PLUS转染试剂(Gibco公司), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech公司), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech公司), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim公司), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega公司).

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体及细胞转染: NS5ATP5蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5为本室构建. 用Lipofectamine PLUS转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP5及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.

1.2.2 细胞mRNA提取: 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了NS5ATP5表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析.

1.2.3 探针标记: 逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中.

1.2.4 芯片制备: 包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.5 杂交及洗涤: 将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.6 检测与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 总RNA及mRNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.2 NS5ATP5蛋白上调基因类型

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为HCV NS5ATP5蛋白的上调基因. 在我们的研究中, 因上调基因种类较多, 故将Cy5/Cy3比值3.000以上的定为上调基因. 共发现有17种基因的表达水平上调, 其中包括4种未知功能基因(表1).

表1 NS5ATP5上调基因类型.
编号Cy3/Cy5比值基因名称
13.009人类lumican(LUM)
23.010人类cullin 2(CUL2)
33.016未知功能基因
43.021人类ATPase
53.049未知功能基因
63.189未知功能基因
73.375人类肌凝蛋白X(MYO10)
83.397人类免疫球蛋白超家族蛋白(Z39IG)
93.592人类丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂
103.686人类墨角藻糖基转移酶8(FUT8)
113.746人类B细胞相关蛋白(BRAG)
124.272人类溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)
134.752人类肿瘤坏死因子，诱导蛋白1
144.918人类TGF-betaIIR α
154.937人类蛋白激酶
165.475人类N-myc下游调节(NDRG1)
177.157未知功能基因
2.3 HCV NS5ATP5蛋白下调基因类型

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCV NS5ATP5蛋白的下调基因. 基于上述同样原因, 本实验将Cy5/Cy3比值0.300以下的定为下调基因. 在我们的研究中发现有12种基因的表达水平下调(表2).

表2 NS5ATP5下调基因类型.
编号Cy3/Cy5比值基因名称
10.163人类核仁蛋白
20.169人T细胞受体重新排列β链基因V区
30.176人类色氨酰-tRNA合成酶(WARS)
40.177人胰岛素样生长因子ⅠIGF-I mRNA
50.215人类促胸腺生成素(TMPO)
60.246人类谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)
70.248人类v-myb鸟类髓母细胞过多症癌基因同族体样2(MYBL2)
80.252人类真核翻译延长因子2(EEF2)
90.268人类衔接子相关蛋白复合体1
100.278人类Mr 10 000热休克蛋白1(HSPE1)
110.286人类tetratricopeptide重复位点2(TTC2)
120.294人类迷你染色体维持缺乏
3 讨论

丙型肝炎病毒基因组的翻译是在有关酶的作用下合成一个长约3 011氨基酸的多蛋白前体, 然后在宿主信号肽酶和病毒编码的蛋白酶作用下裂解为各种蛋白, 即: 结构蛋白C、E1、E2、p7, 和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[25-27], 其中非结构蛋白NS5A具有多种生物学功能, HCV NS5A是病毒编码的一种功能广泛的蛋白质, 参与许多重要的调节过程. HCV NS5A位于HCV多蛋白的羧基末端, 是丝氨酸磷酸化蛋白质, 依磷酸化程度的不同而产生两种不同分子量大小的多肽p56和p58, p58被认为是p56的超级磷酸化产物. NS5A能够反式激活核转录因子NF-κB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用[28]. Ghosh et al[29]研究发现, NS5A蛋白能够抑制细胞周期调节基因p21WAF1, 激活人肝癌细胞中增生细胞核抗原(PCNA)基因, 从而调节细胞凋亡, 促进细胞增生. NS5A cDNA能够使转染的小鼠成纤维细胞NIH 3T3具有转化特性, 且转化细胞移植入裸鼠体内可形成纤维肉瘤灶, 这一证据直接证明了HCV NS5A蛋白的恶性转化潜能[30-32]. 目前认为NS5A蛋白是在细胞蛋白激酶作用下发生磷酸化修饰后发挥生物调节作用的. 不同磷酸化形式的NS5A蛋白具有不同反式激活作用是目前关于NS5A生物学功能研究的热点. 研究发现, NS5A片段转录激活作用最强的位点定位于2 135和2 331 aa之间. NS5A的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区(2 143-2 184, 2 220-2 273 aa)和一个脯氨酸富集区(2 282-2 327 aa). 酸性氨基酸区的酸性氨基酸残基的数量与NS5A的反式激活活性相关, 两个酸性氨基酸区是NS5A的转录激活作用的核心区域, 因此酸性氨基酸区的一些氨基酸的突变可明显影响NS5A的转录激活作用, 但是这些突变更多的是引起蛋白二级结构的改变.

我实验室应用SSH技术对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究, 筛选出了一系列已知及未知功能基因, 并把其中一个未知功能基因克隆化, 命名为NS5ATP5. 为进一步研究NS5ATP5的功能, 从而对NS5A的生理学功能有进一步的了解, 我们应用表达谱芯片技术对NS5ATP5的反式调节基因进行研究.

因基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到2组不同的组织或细胞之间基因表达谱的差异, 故在HCV感染及其致癌机制的研究中具有重要的应用价值. 我们以HepG2细胞基因组DNA为模板, 应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的NS5ATP5基因片段, 常规分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析. 结果表明, 共有人类lumican、人类ATPase、人类免疫球蛋白超家族蛋白、人类丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂等17种基因的表达水平上调, 其中包括4个未知功能基因. 有人类核仁蛋白、人T细胞受体重新排列β链基因V区、人类色氨酰-tRNA合成酶、人胰岛素样生长因子等12种基因的表达水平下调. 总之, 我们的结果表明, NS5ATP5对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 基因芯片技术是研究反式调节基因的有效技术.

编辑:N/A

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