基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因

摘要

目的: 应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响.

方法: 从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA, 常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP11, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞, NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析.

结果: 证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确. NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析. 结果表明, 8种基因的表达水平上调, 10种基因的表达水平下调.

结论: NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响; 基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径, 有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: November 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

在嗜肝病毒中丙型肝炎病毒(HCV)被认为是有引起人类肝脏疾病的主要因素, 感染全世界约2%的人口[1-2]. HCV编码的非结构蛋白5A是一种具有隐性反式激活作用的磷蛋白, 参与调节细胞周期、干扰素耐受、脂质和糖类的代谢以及其他细胞内信号转导, 但其对细胞进程影响的生物学机制所知很少[3-7]. 我们分别应用酵母双杂交[8]、抑制性消减杂交[9]、基因芯片[3]和SV40早期启动子/增强子功能分析[10]等技术从不同角度对NS5A的功能进行研究得到的结果说明, NS5A功能复杂多样. 应用基因芯片技术对NS5A转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2的基因表达谱变化进行比较研究, 我们发现了NS5A上调表达的未知功能基因, 命名为NS5ATP11, 并对之进行了克隆[11]. 我们对NS5ATP11转染肝癌细胞系的基因表达谱进行分析, 获得了部分上调或下调表达及未知功能基因.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞及感受态E.coli JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50 PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega). 真核表达载体及细胞转染HBV HBxAg蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP11为本室构建[25]. 用Lipofectamine PLUS转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP11及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.

1.2 方法

使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了NS5ATP11表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析. 参照Schena et al的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在5×SSC+2 g/L SDS 20 μL杂交液中. 包含1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干. 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱[12-19].

2 结果

真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP11由本室构建. 总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.1 NS5ATP11上调基因（表1）

表1 表达显著增加的基因.

GenBank登陆号	编码蛋白	Cy5/Cy3
NM_014863	B cell RAG associated protein(GALNAC4S-6ST), mRNA B细胞重组激活蛋白结合蛋白	3.000
NM_003463	protein tyrosine phosphatase type IVA, member 1(PTP4A1), mRNA蛋白酪氨酸磷酸酶	3.042
NM_002736	protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type II, beta(PRKAR2B), mRNAcAMP依赖的蛋白激酶	3.175
NM_005627	serum/glucocorticoid regulated kinase(SGK), mRNA血清/糖皮质激素调节激酶	3.358
NM_004827	ATP-binding cassette, sub-family G(WHITE), member 2(ABCG2), mRNAATP结合盒亚家族G	3.453
NM_007268	Ig superfamily protein(Z39IG), mRNAIg超家族蛋白	3.564
D50683	mRNA for TGF-betaIIR alpha, complete cds转化生长因子b2Ra	3.939
NM_006096	N-myc downstream regulated gene 1(NDRG1), mRNA N-myc下游调节基因1	6.376

2.2 NS5ATP11下调基因

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为该基因的下调基因. 结果有10种基因的表达水平下调(表2).

表2 表达显著下降的基因.

GenBank登陆号	编码蛋白	Cy5/Cy3
NM_012248	selenophosphate synthetase 2 (SEPHS2)，mRNA磷酸硒合成酶2	0.161
NM_002388	minichromosome maintenance deficient 3 (S. cerevisiae) (MCM3)，mRNA小染色体维持缺陷3(酿酒酵母)	0.168
NM_002292	laminin，beta 2 (laminin S) (LAMB2)，mRNA层粘连蛋白B2	0.171
NM_001034	ribonucleotide reductase M2 polypeptide (RRM2)，mRNA核糖核苷酸还原酶M2多肽	0.174
NM_004184	tryptophanyl-tRNA synthetase (WARS)，mRNA色氨酸-tRNA合成酶	0.189
NM_001033	Homo sapiens tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (erythroid potentiating activity，collagenase inhibitor) (TIMP1)金属蛋白酶的组织抑制因子	0.223
NM_003254	TRAF and TNF receptor associated protein (TTRAP)，mRNATRAF、TNF受体结合蛋白	0.236
NM_016614	Homo sapiens mRNA for KIAA0968 protein，partial cds KIAA0968蛋白	0.245
AB023185	eukaryotic translation initiation factor 4A，isoform 1 (EIF4A1)，mRNA真核翻译起始因子4A	0.255
BC006997	Ras-GTPase-activating protein(GAP) SH3-domain-binding protein(G3BP)，mRNA Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白	0.256

3 讨论

NS5A是丙型肝炎病毒重要的调节蛋白, 作用于病毒自身及宿主细胞多种功能性蛋白, 调节并改变他们的活性, 为病毒复制与传播提供有利环境和免疫逃避策略. 一些体内外实验证实NS5A可以直接作用或反式调节宿主蛋白及基因表达, 本实验室曾对NS5A基因表达谱变化进行比较, 发现了上调表达的未知功能基因NS5ATP11并将其克隆, 片段全长1 257 bp, 基因产物由418个氨基酸残基(aa)组成. 为了进一步探讨该未知基因的功能, 本实验再次应用基因芯片技术, 对于转染和未转染该基因的HepG2细胞进行了分析, 以期发现其部分下游信息和对HCV NS5A致病机制的影响.

获得的表达显著增加的8类基因包括: B细胞重组激活蛋白结合蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP4A1)、cAMP依赖的蛋白激酶、血清/糖皮质激素调节激酶、ATP结合盒亚家族G、Ig超家族蛋白、转化生长因子β2Rα及N-myc下游调节基因1(NDRG1). 其中NDRG1基因的上调十分显著, Cy5/Cy3>6. 是N-myc下游调节基因家族成员, 这个在多种细胞内高度保守的蛋白被p53和DNA损伤刺激所诱导, 而在细胞生长的条件下表达被抑制, 说明其参与细胞内应激应答机制. 在N-myc敲除的小鼠胚胎及分化早期的组织中, N-myc活性与NDRG1表达呈负相关, 在肿瘤细胞中被分化刺激剂诱导. 研究还发现NDRG1是代谢抑制基因, 说明在细胞分化中可能起作用. 另外报道NDRG1蛋白在细胞内具有穿梭在细胞质及细胞核之间的运动行为, 其磷酸化形式依赖于细胞外刺激剂, 有可能NDRG1在细胞中起到信号的传递作用[13-18]. NS5ATP11对该基因的上调作用可能与NS5A改变细胞周期的生物学功能有关. PTP4A1编码的蛋白是一种蛋白酪氨酸磷酸酯酶, 对大鼠的研究显示, 该基因可能是细胞丝裂源刺激的立早基因[19]. SGK编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 调节细胞的分解代谢信号转导, 刺激肝糖分解和蛋白质水解, 并抑制蛋白和葡萄糖的合成, 参与糖尿病并发症的病理生理反应[20-21]. ABCG2编码的膜结合蛋白属于ATP结合盒(ABC)运输蛋白超家族, 在正常组织中介导细胞内毒性物质的排泄, 防止毒素的堆积, 因此该蛋白也与多种药物耐药相关, 研究发现其在对化疗制剂的抵抗中发挥作用[22-23]. NS5ATP11对上述基因的上调作用可推测该蛋白在细胞代谢和膜运输中的功能.

表达显著降低的基因包括: 磷酸硒合成酶2、小染色体维持缺陷3、层粘连蛋白B2、核糖核苷酸还原酶M2多肽、色氨酸-tRNA合成酶、金属蛋白酶的组织抑制因子、TRAF、TNF受体结合蛋白、真核翻译起始因子4A、Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白以及一个未知功能蛋白. TTRAP编码二价阳离子依赖的磷酸二酯酶, 结合CD40、肿瘤坏死因子受体75和TNF结合因子, 并抑制核因子kappa-B活性, 参与DNA修复和转录因子的激活[24]. G3BP为Ras-GTP酶激活蛋白SH3-域结合蛋白, 物理上与GAP的SH3域结合, 对于Ras的信号转导是必要的. Ras激活时, GAP-G3BP复合体发生组建, 其氨基末端的两个核糖核蛋白基序具有RNA结合蛋白的特征而参与RNA代谢进程[25-28]. 被NS5ATP11下调的另一蛋白是金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1). TIMP是参与细胞外基质降解代谢的基质金属蛋白酶(MMP)特异性抑制物, 可以抑制所有MMP的活性, 在肝纤维化的发生发展中起重要作用[29-30]. NS5ATP11对他的下调可能将对有序的肝再生和抗纤维化产生抑制作用.

总之, NS5ATP11是机体中正常存在的基因, 对其他基因的调节体现了其潜在的生物学功能, 通常情况下只引起细胞正常的生理活动, 但当其表达受到病毒蛋白NS5A上调后, 相关的某些生物信号将被放大或削减, 平衡被打破, 引起一系列病理改变. 我们注意到NDRG1可通过NS5ATP11介导被NS5A显著上调, 对于细胞分化和信号转导具有意义, 但在HCV的制病机制中所承担的角色还不清楚, 尚需进一步的证实.

备注

编辑:N/A

参考文献

1.	成 军. 慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:125-128.  [PubMed]  [DOI]

2.	Cheng J. Molecular pathogenesis of viral hepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 2002;16:A185.  [PubMed]  [DOI]

3.	Reed KE, Gorbalenya AE, Rice CM. The NS5A/NS5 proteins of viruses from three genera of the family flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. J Virol. 1998;72:6199-6206.  [PubMed]  [DOI]

4.	Park KJ, Choi SH, Lee SY, Hwang SB, Lai MM. Nonstructural 5A protein of hepatitis C virus modulates tumor necrosis factor alpha-stimulated nuclear factor kappa B activation. J Biol Chem. 2002;277:13122-13128.  [PubMed]  [DOI]

5.	He Y, Nakao H, Tan SL, Polyak SJ, Neddermann P, Vijaysri S, Jacobs BL, Katze MG. Subversion of cell signaling pathways by hepatitis C virus nonstructural 5A protein via interaction with Grb2 and P85 phosphatidylinositol 3-kinase. J Virol. 2002;76:9207-9217.  [PubMed]  [DOI]

6.	Qadri I, Iwahashi M, Simon F. Hepatitis C virus NS5A protein binds TBP and p53, inhibiting their DNA binding and p53 interactions with TBP and ERCC3. Biochim Biophys Acta. 2002;1592:193-204.  [PubMed]  [DOI]

7.	Lan KH, Sheu ML, Hwang SJ, Yen SH, Chen SY, Wu JC, Wang YJ, Kato N, Omata M, Chang FY. HCV NS5A interacts with p53 and inhibits p53-mediated apoptosis. Oncogene. 2002;21:4801-4811.  [PubMed]  [DOI]

8.	王 琳, 李 克, 成 军. 筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白基因. 解放军医学杂志. 2003;28:54-56.  [PubMed]  [DOI]

9.	刘 妍, 陆 荫英, 成 军. 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究. 解放军医学杂志. 2003;28:40-43.  [PubMed]  [DOI]

10.	洪 源, 刘 妍, 成 军, 杨 倩, 王 建军. 应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究. 世界华人消化杂志. 2003;11:939-942.  [PubMed]  [DOI]

11.	王 琳, 李 克, 成 军, 张 健, 梁 耀东, 刘 妍. 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究. 胃肠病和肝病学杂志. 2003;12:257-259.  [PubMed]  [DOI]

12.	Kurdistani SK, Arizti P, Reimer CL, Sugrue MM, Aaronson SA, Lee SW. Inhibition of tumor cell growth by RTP/rit42 and its responsiveness to p53 and DNA damage. Cancer Res. 1998;58:4439-4444.  [PubMed]  [DOI]

13.	Shimono A, Okuda T, Kondoh H. N-myc-dependent repression of ndr1, a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant. Mech Dev. 1999;83:39-52.  [PubMed]  [DOI]

14.	Wakisaka Y, Furuta A, Masuda K, Morikawa W, Kuwano M, Iwaki T. Cellular distribution of NDRG1 protein in the rat kidney and brain during normal postnatal development. J Histochem Cytochem. 2003;51:1515-1525.  [PubMed]  [DOI]

15.	van Belzen N, Dinjens WN, Diesveld MP, Groen NA, van der Made AC, Nozawa Y, Vlietstra R, Trapman J, Bosman FT. A novel gene which is up-regulated during colon epithelial cell differentiation and down-regulated in colorectal neoplasms. Lab Invest. 1997;77:85-92.  [PubMed]  [DOI]

16.	Xu B, Lin L, Rote NS. Identification of a stress-induced protein during human trophoblast differentiation by differential display analysis. Biol Reprod. 1999;61:681-686.  [PubMed]  [DOI]

17.	Piquemal D, Joulia D, Balaguer P, Basset A, Marti J, Commes T. Differential expression of the RTP/Drg1/Ndr1 gene product in proliferating and growth arrested cells. Biochim Biophys Acta. 1999;1450:364-373.  [PubMed]  [DOI]

18.	Agarwala KL, Kokame K, Kato H, Miyata T. Phosphorylation of RTP, an ER stress-responsive cytoplasmic protein. Biochem Biophys Res Commun. 2000;272:641-647.  [PubMed]  [DOI]

19.	Carter DA. Expression of a novel rat protein tyrosine phosphatase gene. Biochim Biophys Acta. 1998;1442:405-408.  [PubMed]  [DOI]

20.	Maiyar AC, Leong ML, Firestone GL. Importin-alpha mediates the regulated nuclear targeting of serum- and glucocorticoid-inducible protein kinase (Sgk) by recognition of a nuclear localization signal in the kinase central domain. Mol Biol Cell. 2003;14:1221-1239.  [PubMed]  [DOI]

21.	Firestone GL, Giampaolo JR, O'Keeffe BA. Stimulus-dependent regulation of serum and glucocorticoid inducible protein kinase (SGK) transcription, subcellular localization and enzymatic activity. Cell Physiol Biochem. 2003;13:1-12.  [PubMed]  [DOI]

22.	Abbott BL. ABCG2 (BCRP) expression in normal and malignant hematopoietic cells. Hematol Oncol. 2003;21:115-130.  [PubMed]  [DOI]

23.	Zhao R, Goldman ID. Resistance to antifolates. Oncogene. 2003;22:7431-7457.  [PubMed]  [DOI]

24.

Pype S, Declercq W, Ibrahimi A, Michiels C, Van Rietschoten JG, Dewulf N, de Boer M, Vandenabeele P, Huylebroeck D, Remacle JE. TTRAP, a novel protein that associates with CD40, tumor necrosis factor (TNF) receptor-75 and TNF receptor-associated factors (TRAFs), and that inhibits nuclear factor-kappa B activation. J Biol Chem. 2000;275:18586-18593.  [PubMed]  [DOI]

25.	French J, Stirling R, Walsh M, Kennedy HD. The expression of Ras-GTPase activating protein SH3 domain-binding proteins, G3BPs, in human breast cancers. Histochem J. 2002;34:223-231.  [PubMed]  [DOI]

26.	Barnes CJ, Li F, Mandal M, Yang Z, Sahin AA, Kumar R. Heregulin induces expression, ATPase activity, and nuclear localization of G3BP, a Ras signaling component, in human breast tumors. Cancer Res. 2002;62:1251-1255.  [PubMed]  [DOI]

27.	Liu Y, Zheng J, Fang W, You J, Wang J, Cui X, Wu B. Identification of metastasis associated gene G3BP by differential display in human cancer cell sublines with different metastatic potentials G3BP as highly expressed in non-metastatic. Chin Med J (Engl). 2001;114:35-38.  [PubMed]  [DOI]

28.	Kennedy D, French J, Guitard E, Ru K, Tocque B, Mattick J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. J Cell Biochem. 2001;84:173-187.  [PubMed]  [DOI]

29.	Peng ZM, Yang ZL, Liu YW. [Expression of MMP1 and TIMP1 proteins in lung cancer and its biological significance]. Hunan Yikedaxue Xuebao. 2002;27:159-161.  [PubMed]  [DOI]

30.	Wang A, Yang X, Wang W, Zuo F, Wang Q, He F. [Effect of recombinant human augmenter of liver regeneration on gene expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in rat with experimental liver fibrosis]. Zhonghua Yixue Zazhi. 2002;82:610-612.  [PubMed]  [DOI]