研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2737-2739
在线出版日期: 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2737
应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白
杨艳杰, 成军, 陈东风, 王春花, 黄燕萍, 吴煜, 刘敏, 王建军, 钟彦伟, 刘妍, 张黎颖
杨艳杰, 成军, 王春花, 黄燕萍, 吴煜, 刘敏, 王建军, 钟彦伟, 刘妍, 张黎颖, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100038
陈东风, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院消化内科 重庆市 400038
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-02-14
修回日期: 2004-05-30
接受日期: 2004-06-09
在线出版日期: 2004-11-15

目的: 通过筛选HBsAg基因启动子I(surface promoter I, SP Ⅰ)结合蛋白, 为HBV复制机制的研究探索新的途径.

方法: 应用噬菌体展示技术, 以HBsAg基因启动子I的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子, 对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程, 经噬斑的PCR扩增后, 构建克隆载体, 最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.

结果: 噬菌体经富集后, 从随机筛选的14个克隆中得到8个阳性克隆, 成功构建了克隆载体. 序列测定后经过同源性搜索, 确定了和HBV表面抗原基因启动子I特异结合的肝细胞蛋白, 共编码7种蛋白. 其中3个克隆编码未知功能蛋白; 其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白.

结论: 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子I的结合蛋白, 分析了该蛋白的编码基因.

关键词: N/A
引文著录: 杨艳杰, 成军, 陈东风, 王春花, 黄燕萍, 吴煜, 刘敏, 王建军, 钟彦伟, 刘妍, 张黎颖. 应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白. 世界华人消化杂志 2004; 12(11): 2737-2739
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: February 14, 2004
Revised: May 30, 2004
Accepted: June 9, 2004
Published online: November 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)持续感染导致全球性健康问题. 世界人口约6%是病毒携带者, 因此HBV是慢性肝病的重要病原体, 且是引发肝细胞癌(HCC)的重要因素[1-5], 而病毒基因组编码的蛋白与宿主肝细胞之间的相互作用, 可能是病毒致肝细胞癌的重要分子机制[6-12]. HBV基因组分为结构基因序列和调节基因序列两大部分. 调节基因序列和结构基因序列相互重叠, 即使结构基因序列本身也有部分重叠, 因此, HBV具有结构紧密的特点. HBsAg基因含有两个串联的启动子SP Ⅰ和SP Ⅱ. 其中SP Ⅰ(2 219-2 780 nt)调节2.4 kb mRNA的转录, 编码表面抗原大蛋白. 在HBV复制中具有十分重要的作用. SP Ⅰ含有典型TATA盒序列, 其上游50 bp处为肝细胞特异性核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)1结合位点. 该结合位点是HBV转录调节的重要组分, 也是HBV嗜肝性的重要原因之一; 这一位点可能还有其他肝特异因子与之结合, 从而调节2.4 kb mRNA的转录[13-14]. 另外, SPⅠ的腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)核苷酸丰富区中还有一个AFP-1(一种可与AFP基因的增强子及启动子结合的核因子)结合位点, 也可能与肝细胞特异性的转录有关. 因此, 作为指导前-S基因组RNA转录的SPI启动子在HBV的生活周期中具有十分重要的作用. 为了寻找与SP Ⅰ结合的肝特异性转录作用因子, 进一步探讨SP Ⅰ的转录调节机制, 我们应用噬菌体展示技术, 利用人肝细胞cDNA文库, 以生物素化的SP Ⅰ的DNA作为固相分子进行筛选, 研究影响HBV DNA复制的肝细胞蛋白的结构和功能.

1 材料和方法
1.1 材料

T7 select人肝细胞cDNA文库, 受体菌BLT5615(Novagen公司), 质粒pGEM-Teasy和pcDNA3.1(-)(Promega公司), Taq酶、琼脂糖、dNTP、T4连接酶、RNA酶、玻璃奶DNA回收试剂盒(博大科技), EcoRⅠ、BamHⅠ、MluⅠ、NheⅠ(购于宝生物公司), 热循环仪、凝胶成像仪、酶联吸附读数仪、大肠杆菌DH5α、pCP10质粒为本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 肝细胞cDNA文库的筛选: HBV SP Ⅰ启动子的扩增根据HBV ayw的基因序列, 在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡核苷酸引物, 并用生物素标记, P1: 5'-ACGCGTGAACATCTAGTTAATC-3', P2: 5'-GCT AGC GCT GTA GAT CTT GTT C-3'在引物5'端分别引入MluⅠ和NheⅠ位点, 由赛百盛公司合成. 在0.5 mL Ep管中依次加入17 μL双蒸水, 2.5 μL的10×缓冲液(含20 mmol/L MgCL2), 2 μL 2 mmol/L dNTP, 1 μL 12.5 μmol/L P1和P2, 1 μL pCP10质粒, 0.5 μL Taq酶(5 Mu/L). 放入PE 9 600 PCR仪中扩增. 扩增条件: 94 ℃变性60 s, 57 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 循环33次后, 72 ℃保温10 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果. 玻璃奶法回收DNA片段. 文库扩增: 将BLT5615新鲜克隆在3 mL LB/Amp内振摇, 37 ℃过夜. 在3 mL LB/Amp内加入30 μL振摇细菌, 将细菌浓度摇至A600值0.5, 加入30 μL IPTG, 再振摇30 min后加入噬菌体文库5 μL. 37 ℃振摇1-3 h直到观察到细菌裂解. 8 000 g离心10 min, 将上清移至另一无菌Ep管中, 4 ℃保存. 链亲和素20 μL(1 g/L)包被微孔板, 4 ℃过夜. 1×TBS洗涤, 加入100 μL SP Ⅰ启动子DNA回收片段, 4 ℃过夜. 1×TBST(5 g/L Tween-20)洗涤5遍, 加入文库扩增裂解液100 μL, 4 ℃过夜. 1×TBST洗板5次, 加入100 μL T7洗脱缓冲液, 室温孵育20 min, 将洗脱液移至另一无菌Ep管中. 将15 μL洗脱噬菌体加入3 mL中对数生长期的细菌培养液, 37 ℃振摇培养, 直到看到细菌裂解. 8 000 g离心10 min, 将上清移到一新Ep管, 4 ℃保存备下一轮筛选用. 每轮筛选后, 均做噬斑分析. 按上述步骤再筛选5遍.

1.2.2 噬斑的PCR扩增: 刮取第5轮筛选后的阳性噬斑, 置于100 μL pH 8.0的10 mol/L EDTA的Ep管中, 65 ℃加热10 min, 14 000 g离心10 min至澄清. 在0.5 mL管中依次加入40 μL双蒸水, 5 μL的10×缓冲液(含20 mmol/L MgCL2), 4 μL 2 mmol/L dNTP, 1 μL 12.5 μmol/L T7 select上游引物P3: 5'-GGA GCT GTC GTA TTC CAG TC-3'和下游引物P4: 5'-AAC CCC TCA AGA CCC GTT TA-3', 1 μL pCP10质粒, 0.5 μL Taq酶(5 Mu/L)放入PE 9 600 PCR仪中扩增. 扩增条件: 94 ℃变性60 s, 50 ℃退火55 s, 72 ℃延伸60 s, 循环35次后, 72 ℃保温10 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果. 玻璃奶法回收DNA片段.

1.2.3 序列比对和同源性分析: 将纯化的噬斑PCR产物与pGEM-Teasy载体混合, 在16 ℃条件下用T4 DNA连接酶连接过夜, 随后转化用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞, 在铺有IPTG/X-gal的氨苄西林平板上进行蓝白斑菌落筛选, 挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒, 进行酶切鉴定. 以酶切鉴定阳性的重组子为模板, 进行目的基因的DNA序列测定, 序列测定由上海博亚生物公司完成. 同源性搜索由以下网址上的BLASTn软件完成(http: //http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn).

2 结果
2.1 肝细胞cDNA文库的筛选

以固相化的SPI启动子DNA片段作为支持分子, 对肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选. 噬菌体的富集结果见表1. 从固相平板洗脱的噬菌体数显示了明显的增加趋势, 第4轮与第1轮相比, 富集了356倍(富集倍数=第4轮产出率/第1轮产出率 产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量).

表1 亲和筛选对噬菌体的富集.
筛选次数噬菌体数
产出率
投入捕获
第1轮3.5×1082.5×10117.1×102
第2轮2.5×10112.6×10151.0×104
第3轮2.6×10151.5×10205.8×104
第4轮1.5×10203.8×10252.5×105
2.2 目的基因的PCR扩增

经过4轮筛选, 随机挑取14个噬斑为模板, 用T7 select引物进行PCR扩增, PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳. 结果产生片段大小不等的条带(图1), 用同一噬斑裂解液重复PCR得到相同结果.

图1
图1 阳性噬斑裂解液PCR扩增.
2.3 序列比对和同源性分析

对阳性克隆基因的DNA序列测定, 及根据GenBank数据库提供的数据库进行BLASTn同源性搜索, 8个阳性克隆筛选到启动子DNA结合蛋白, 共编码7种蛋白. 其中3个克隆编码未知功能蛋白; 其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白(表2).

表2 应用噬菌体展示技术筛选到的阳性克隆.
编号编码蛋白同源性(%)克隆数
1isolate 183 mitochondrion(孤立线粒体183)991
2RF-C/activator 1 homolog(释放因子C/激活因子1同源体)1001
3hypothetical protein MGC9515(人类假想蛋白MGC9515)992
4haptoglobin(触珠蛋白)991
54-aminobutyrate aminotransferase(4-氨基丁酸氨基转移酶)1001
6chromosome 3 clone RP11-801L18(复制蛋白11-801L18)1001
7hypothetical protein FLJ22056(人类假想蛋白FLJ22056)1001
3 讨论

作为调节元件的一段DNA序列, 可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合, 正性或负性调节转录. HBV的SP Ⅰ启动子是HBV的一个重要调节元件. 转录因子HNF1和HNF3对SPⅠ的转录调节具有重要作用, 他们作用的位置在肝脏而不在其他组织. 这两种因子协同作用可能抑制2.4 kb mRNA的转录. 在多聚腺苷酸(PolyA)加尾信号、糖皮质激素应答元件(GRE)、增强子Ⅰ(ENHⅠ)、增强子Ⅱ(ENHⅡ)和HBxAg及其他的细胞因子作用下顺式或反式激活SP Ⅰ, 开始发挥调节功能[15-16]. SP Ⅰ调节2.4 kb的mRNA转录, 编码大蛋白. 对HBV转基因鼠的研究显示, 2.4 kb mRNA在肝组织内呈严格分布, 具有高度的嗜肝性. 由于大蛋白的增加易导致病毒包膜蛋白在细胞内蓄积, 引起细胞病变效应[17-18]. HBV各种包膜蛋白的这种比例不仅有利于感染性HBV颗粒成熟和释放, 而且有利于宿主细胞的生存, 使二者能共生共存[19-20]. 因此, 3种外膜蛋白的产量有正常比例, 大蛋白过量时, 将顺式干扰SP Ⅱ, 从而降低基因的转录水平. Li et al[21]从1例慢性肝炎患者血清中分离到S基因启动子缺失变异株, 转染肝癌细胞后, 大蛋白过度表达, 而中、主蛋白表达减少, 因而病毒及亚病毒颗粒的分泌都受到抑制, 肝细胞内大蛋白堆积, 认为可能是慢性肝炎肝细胞毛玻璃样变性的原因. 他们进一步研究发现, 过度表达的大蛋白在肝细胞内质网通过激活grp78和grp94启动子, 改变宿主细胞的生理功能[22-24]. 转基因小鼠模型已经证实, 若大蛋白过度表达, 在肝细胞内堆积, 将导致肝细胞内质网肿胀, 肝细胞变性. 因此, 在感染过程中, 改变大、中、小蛋白的比例将影响疾病的进程.

我们以已知启动子DNA序列筛选出与其相结合的蛋白编码基因, 通过生物息信分析来确定该蛋白质的名称. 经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程, 结果得到了8个阳性克隆, 共表达7种蛋白. 其中有3个为未知功能蛋白, 对已知功能蛋白, 如4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白(haptoglobin)、复制蛋白等蛋白的结合作用, 尚未见有文献报道, 需体外结合及真核细胞共转染等实验进一步证实. 总之, 本实验应用噬菌体展示技术, 试图寻找与HBV SP Ⅰ启动子结合的肝特异蛋白及HBV、特别是表面抗原大蛋白严格嗜肝性的原因, 探索病毒表面抗原大蛋白转录、翻译的调控机制. 通过本实验, 我们筛选到了一些与SP Ⅰ启动子序列特异结合的蛋白, 为今后更好地了解HBV的转录调控机制及其生活史打下了基础.

编辑:N/A

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