修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15
目的: 为了研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-36的生物学功能, 我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-36分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析, 筛选能被E-36反式调节的靶基因.
方法: 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-36蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体 pcDNA3.1(-)-E-36. 以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.
结果: 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确. 提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA, 进行DNA芯片技术分析. 在1 159个基因表达谱的筛选中, 发现有20个基因表达水平显著上调, 包括甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白、SLIT2、核因子B、白介素受体3、白介素6、血管紧张素I转换酶、急性髓细胞性白血病1b、caspase 2、低密度脂蛋白1、T 细胞受体重组链、肿瘤坏死因子受体、肿瘤抑制亚转化因子、细胞周期相关激酶-2、亲代谢性谷氨酸盐受体-7、唾液酸转移酶-8及5个未知蛋白; 真核细胞翻译延伸因子2基因的表达水平显著下调.
结论: E-36基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响. DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
引文著录: 陆荫英, 刘妍, 成军, 梁耀东, 陈天艳, 邵清, 王琳, 张玲霞. 乙型肝炎病毒e抗原肝细胞结合蛋白新基因E-36基因表达谱芯片分析. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 66-69
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004
AIM: To investigate the biological functions of a novel hepatitis B virus e antigen (HBeAg) binding protein E-36, and to screen genes regulated by E-36.
METHODS: The E-36 coding DNA fragment was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique from HepG2 cell. The expressive vector of pcDNA 3.1-E-36 was constructed by routine molecular biological methods. The HepG2 cells were transfected by pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1-E-36, respectively by using lipofectamine. The total RNA was isolated and reverse transcribed. The cDNAs were subjected to microarray screening with 1 152 cDNA probes.
RESULTS: The expressive vector was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis. High quality mRNA and cDNA of transfected HepG2 cells were prepared and successful microarray screening conducted. From the scanning results, 20 genes were found to be up-regulated, including PTH-responsive osteosarcoma B1 protein, slit homolog 2, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1, interleukin 3 receptor, caspase 2, angiotensin I converting enzyme, Low density lipoprotein 1, interkeukin 6, T-cell receptor rearranged beta chain gene V-region, activator of NFB, tumor suppressing subtransferable candidate 1, cyclin-dependent kinase-like 2, sialyltransferase 8, glutamate receptor, metabotropic 7, and 5 novel genes. Expression of the gene of eukaryotic translation elongation factor 2 could be down-regulated by E-36 protein.
CONCLUSION: The expression of E-36 protein affects the expression spectrum of HepG2 cell. The microarray is an important technique for the study of transactivating effects for viral proteins.
- Citation: Lu YY, Liu Y, Cheng J, Ling YD, Chen TY, Shao Q, Wang L, Zhang LX. Screening and identification of genes trans-regulated by a novel HBeAg binding protein E-36 with cDNA microarray assay. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(1): 66-69
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i1/66.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i1.66
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前C区编码的一种非颗粒性的分泌蛋白, 临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一[1,2], 现普遍认为他是一种免疫耐受因子, 调节乙型肝炎的免疫发病机制[3,4]. 但HBeAg与肝细胞之间是通过那些环节发生作用、如何作用以及作用后产生何种效应, 在此方面的研究较少且没有明确的结果, 因此寻找HBeAg与肝细胞间的相互作用蛋白, 并进一步明确其间的作用机制、作用效应, 可望能发现有价值的HBV感染防治途径. 前一阶段我们用酵母双杂交技术筛选出了一个未知功能的HBeAg结合蛋白基因E-36, 并进一步用体外免疫共沉淀技术进行再次验证[5-13], 为研究其具体生物学功能, 用基因表达谱芯片技术筛选能被E-36反式调节的蛋白基因, 为全面深入了解E-36的功能及其在HBV致肝细胞损伤中的作用研究铺垫了道路.
HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS 转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega), Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I、BamH I和Pst I等限制性内切酶购于Takara生物公司, 新基因E-36扩增引物(P3 5'- GAATTCATGTCCTATCCAGCCCTTCACCAG-3', P4 5'-GGATCCTCAGCAGCAGGCGGAAA CGCTCGTC-3')由合成及DNA测序由上海博亚公司承担.
1.2.1 真核表达载体及细胞转染: E-36蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-E-36由本室构建. 用Lipofectamine PLUS 转染试剂将2 g pcDNA3.1(-)-E-36及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2 细胞, 48 h后收获细胞.
1.2.2 细胞mRNA提取: 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了E-36表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析.
1.2.3 探针标记: 逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA (5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 g).乙醇沉淀后溶解在20 L 5× SSC+2g/L SDS杂交液中.
1.2.4 芯片制备: 包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/ L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(uv)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
1.2.5 杂交及洗涤: 将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 2g/L SDS、0.1×SSC +2 g/L SDS、0.1×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
1.2.6 检测与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.
E-36蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)- E-36构建成功, 经相应的限制性内切酶消化鉴定正确.
总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与 -20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.
在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为E-36蛋白的上调基因. 在本研究中发现有20种基因的表达水平上调(表1), 1种真核细胞翻译延伸因子2基因表达下调.
| 差异表达基因 | GenBahk Nunmber |
| 甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白 | 014451 |
| SLIT2 | 004787 |
| 核因子B | 003998 |
| 白介素受体3 | 000600 |
| 白介素6 | 032982 |
| 血管紧张素I转换酶 | 021804 |
| 急性髓细胞性白血病1b | D43968 |
| caspase 2 | 002183 |
| 低密度脂蛋白1 | 004525 |
| T 细胞受体重组链 | M11952 |
| 肿瘤坏死因子受体 | 003839 |
| 肿瘤抑制亚转化因子 | 003310 |
| 细胞周期相关激酶-2 | 003948 |
| 亲代谢性谷氨酸盐受体-7 | 000844 |
| 唾液酸转移酶-8 | 003034 |
| 未知蛋白 | BG171632 |
| 未知蛋白 | 007211 |
| 未知蛋白 | AK025638 |
| 未知蛋白 | AB020676 |
| 未知蛋白 | 014887 |
普遍认为HBeAg一种免疫调节因子, 可调节宿主的免疫应答, 与HBV感染形成的免疫耐受有关. 当HBeAg发生突变时, 失去血清中HBeAg的调节, 可导致病情加重; 血中抗-HBe长期阳性的患者, 发生肝硬化、肝癌的几率较高, 原因不清, 是研究有效防治乙型肝炎病毒(HBV)感染的难点之一[14-18]. 前一阶段通过酵母双杂交技术和体外免疫共沉淀技术, 我们发现并验证了肝细胞中与HBeAg有相互作用未知蛋白E-36, 为深入研究HBeAg的生物学功能迈出了可喜的一步. 但是, 对于一个新蛋白来说, 由于人们以往对其没有认识, 需要对他的表达调控、翻译后修饰、生物学功能以及相互作用等方面进行研究, 这是一项艰巨而有挑战性的工作, 有望对HBV感染的诊断、预后及疗效判断等提出新的参考[19-21].
我们用基因表达谱芯片对新蛋白E-36作了初步的研究, 构建pcDNA3.1(-)-E-36真核表达载体, 将空载体作为对照共同转染HepG2细胞, 发现E-36的表达可使HepG2细胞中20种基因的表达水平上调, 1种真核细胞翻译延伸因子2基因表达下调. 在上调中有肿瘤相关基因如急性髓细胞性白血病1b 、肿瘤抑制亚转化因子、甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白等; 有细胞信号转导、细胞凋亡相关的基因如细胞周期相关激酶-2、caspase 2、核因子B及一些酶.
其中SLIT2是一种分泌型的富含亮氨酸重复区的蛋白质, 有明确的肿瘤抑制作用, SLIT2转染COS-7细胞的培养液能延缓细胞的生长和诱导SW48结肠癌细胞凋亡, SLIT2的过表达可以抑制70%的体外培养乳腺癌细胞的集落化生长, 在发生肺癌及乳腺癌时, 由于其启动子的甲基化或等位基因的丢失而导致其失活[22-25]. 转录因子NF-B在缺乏引导信号时主要存在于细胞质中, 受一些炎性因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1(IL-1)等的刺激细胞后发生降解、抑制, 使NF-B能够在胞核内沉积, 从而调节一些特殊基因的表达[26,27]. 唾液酸转移酶-8是糖基转移酶家族中的成员, 存在于高尔基体中, 具有催化细胞黏附分子-神经节甙酯聚唾液酸化的功能, 神经节甙酯是一类膜结合的含唾液酸的鞘糖脂, 是细胞黏附和体外培养恶性细胞生长的重要因子. 白介素3受体α链有促进髓样分化的作用, 在急性髓样白血病患者中的高表达可导致白血病细胞的爆发增生, 缩短完全缓解期及存活期, 使病情恶化[28,29].E-36能上调这些基因的表达, 说明E-36可能在介导HBeAg参与肿瘤的发生过程中起作用.
半胱氨酸蛋白酶(caspases-2)是细胞死亡基因(CED-3)/白介素1转化酶蛋白酶(interleukin-1beta-converting enzyme (ICE) protease)家族中的一员, 定位于细胞核中, 是细胞凋亡早期过程中一个非常重要的蛋白酶, 被细胞因子激活后产生分解细胞的作用, 导致细胞凋亡. caspases-2还是线粒体渗透必需的酶, 各种细胞因子通过不同途径活化caspases, 或通过聚合形成受体复合物直接激活caspases, 引起线粒体渗透扩大而不是起始caspases的活化来加速细胞分解[30,31]. 亲代谢性谷氨酸盐受体-7(metabotropic glutamate receptor), 是G蛋白耦合受体家族III, 与环磷腺苷(cAMP)级联途径的抑制有关, 谷氨酸盐在中枢神经系统中是一类主要的兴奋性神经递质, 他可激活亲离子性和亲代谢性谷氨酸盐受体. E-36能上调这些基因的表达, 提示其可能参与细胞信号转导途径.
随着后基因组时代的到来, 越来越多的未知功能蛋白质被发现, 对新蛋白的生物学功能、与其他蛋白质间的相互作用以及他们在疾病发生、发展、转化过程中的变化规律的研究成为今天生命科学最重要的热点之一, 同时由于新技术的不断创新, 使一系列的研究成为可能.我们应用基因表达谱芯片技术对E-36新基因的功能进行了初步的研究, 并获得一些有价值的结果, 为下一步的深入研究奠定了基础[32,33].
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