修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
利用分子生物学技术, 研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用, 克隆HBxAg反式激活作用的靶基因, 为进一步探索HBxAg的反式激活作用, 以及反式激活作用的靶基因, 阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制, 为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.
利用聚合酶链反应(PCR)技术, 扩增HBxAg的编码基因, 构建表达载体pcDNA3.1(-)-X, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA, 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析. 对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索, 确认为与已知的功能基因无同源性之后, 利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对, 进行电子拼接, 完成新基因序列的确定. 然后自HepG2细胞提取总mRNA, 应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物, 进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增, 获得阳性克隆之后, 进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.
PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列, 经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误. 转染HepG2细胞并提取足量的mRNA, 利用SSH技术进行分析, 获得的基因片段序列分析结果表明, 其中之一为新型基因片段序列, 与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性. 通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对, 电子拼接成功, 根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列, 确定新型基因序列. 从HepG2细胞提取总mRNA, 以RT-PCR技术, 扩增获得该新基因的全基因序列, 并测序证实, 命名为XTP1, 在GenBank中注册, 注册号为AF488828.
利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合, 发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1, 并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
引文著录: 刘妍, 成军, 王琳, 王建军, 陆荫英, 李克. 乙型肝炎病毒x蛋白激活基因1的克隆化与序列分析. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1107-1113
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003
To study the transactivation effects of HBxAg, and clone the target genes of HBxAg transactivating effects, in order to help understand the mechanism of pathogenesis of HBxAg.
Polymerase chain reaction (PCR) was employed to amplify the coding sequence of HBxAg. The hepatoblastoma cell HepG2 was transfected by pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1(-)-X, respectively. Total mRNA was purified from the HepG2 cells transfected and suppression subtractive hybridization(SSH) method was used to analyze the differentially expressed DNA sequence between the two groups. The sequences were searched for homologous DNA sequence from GenBank. The new DNA sequence was confirmed and the full-length coding sequence was identified according to the Kozak rule and the existence of polyadenyl signal sequences. Reverse transcription PCR (RT-PCR)was used to amplify the new gene by using mRNA from HepG2 cell as the template. The coding sequence for the new gene was deduced according to the nucleotide sequence.
PCR technique was employed to amplify the coding sequence for HBxAg by using pCP10 plasmid containing whole HBV genome as the template. The recombinant plasmid expressing HBxAg was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. HepG2 cells were transfected with pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1(-)-X by lipofectamine, respectively. Total mRNA was purified from transfected HepG2 cell, and suppression subtractive hybridization method was used for the screening and identification of differentially expressed genes by these two cell groups. After sequencing, each DNA sequence was compared with the genes deposited in the GenBank and the new gene with no homology with known genes in this database was identified. Electric polymerase chain reaction was conducted for the cloning of the full-length DNA of the new gene and in conjunction with Kozak rule and the existence of polyadenyl signal sequence. RT-PCR technique was used to amplify the new gene, named as XTP1, from the mRNA of HepG2 cells. The sequence for the XTP1 gene was deposited into GenBank, and the accession number is AF488828.
A new gene named XTP1 which is transac-tivated by hepatitis B virus X protein has been successfully cloned by molecular biological methods. These results pave the way for the study of the molecular mechanism of HBxAg transactivating effects and the development of new therapy for chronic hepatitis B.
- Citation: Liu Y, Cheng J, Wang L, Wang JJ, Lu YY, Li K. Cloning and identification of human gene 1 transactivated by hepatitis B virus X antigen. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(8): 1107-1113
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i8/1107.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i8.1107
乙型肝炎病毒(HBV)的X基因编码产物(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白. 各种血清型和基因型的HBV编码的HBxAg大小不等, 但一般由145-154个氨基酸残基(aa)组成, HBxAg蛋白的氨基末端相对保守, 但羧基末端相对高变[1-15]. 近年来研究的资料表明, HBV X基因可以发生插入、缺失、碱基颠换、终止密码子的提前出现以及准种(quasispecies)等特点, 在发现HBxAg的初期阶段, 并不清楚其生物学功能. 目前认为其主要的生物学功能就是作为HBV基因组表达的反式调节蛋白, 在HBV基因组的复制和表达过程中具有十分重要的作用[16-20]. HBxAg的反式激活功能不仅仅限于HBV基因组中不同的调节基因序列, 而且对于其他一系列不同病毒的基因启动子的活性、肝细胞等宿主细胞某些重要基因的表达调节也产生影响. HBxAg对于肝细胞等的基因表达谱的影响在HBV感染的致病机制过程中具有十分重要的地位和作用. 这一作用机制是HBV感染相关性肝细胞癌(HCC)发生发展的重要分子生物学机制. 近年来在细胞凋亡(apoptosis)和细胞周期的分子生物学调控方面的研究进展积累了丰富的资料[21-24]. 相信HBxAg对于HBV感染肝细胞的细胞凋亡和细胞周期的调控是HBV感染引起HCC的重要的分子生物学基础.
关于HBxAg反式激活的靶基因的研究已经积累了丰富的资料, 使我们对于HBxAg的反式激活作用及其部分机制有了清楚的了解[25-27]. 但是, 关于HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制研究仍然有许多方面知之甚少, 需要利用现代的分子生物学技术进行新的开拓. 我们利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH), 对于表达HBxAg载体转染的HepG2细胞进行研究, 阐明了部分HBxAg的反式激活作用的靶基因, 同时我们结合生物信息学技术(bioinformatics)克隆了HBxAg蛋白反式激活作用的新的靶基因, 即乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1(XTP1), 从而为HBxAg反式激活作用的研究提供能了新的研究方向.
DNA回收纯化试剂购于Bio 101公司, 克隆载体pCR2.1及细胞转染试剂lipofectamine购于Invitrogen公司, T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自Takara公司, 质粒提取试剂及β-gal检测试剂购自Promega公司. 抑制性消减杂交试剂盒及相关试剂购自Clontech公司.
1.2.1 目的基因的扩增与纯化 以质粒pCP10中所含的HBV ayw亚型的DNA序列为模板, 用PCR方法扩增HBxAg基因片段. 采用冷启动方式进行PCR, 参数为94 °C预变性1 min, 94 °C 50 s, 55 °C 50 s, 72 °C 40 s, 共30个循环; 72 °C延伸10 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 切胶, 回收纯化500 bp DNA条带.
1.2.2 真核表达载体的构建、纯化和DNA测序 以T-A克隆法, 将目的基因片段插入载体pCR2.1, XhoI单酶切, 电泳鉴定插入基因片段的方向性. 将获得的质粒pCR2.1-X和真核表达载体pcDNA3.1(-)分别用Hind III和Apa I双酶切, 用T4 DNA连接酶进行定向连接, 产物转化DH5α细菌, 筛选抗氨苄青霉素阳性菌落; 提取质粒, 酶切及PCR鉴定含有HBxAg基因的阳性克隆, 命名为pcDNA3.1(-)-X. DNA测序由Takara公司完成.
1.2.3 HBxAg蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达 试剂盒方法提取质粒以备转染, 以标准方案培养COS-7细胞. 具体转染方法参照说明书进行. 转染48 h后, 收集细胞, 以ELISA方法检测细胞中HBxAg蛋白的瞬时表达.
1.2.4 pcDNA3.1(-)-X与pSV-lacZ共转染COS-7细胞 用0.1-1.2 μg不同梯度pSV-lacZ质粒转染COS-7, 检测β-gal的表达, 选择合适的报告质粒用量. 再用一定量的pSV-lacZ 和pcDNA3.1(-)-X, 不同比例的脂质体共转染COS-7, 检测β-gal的表达, 选择最佳脂质体用量. β-gal的检测采用Promega试剂盒方法. 以选择的最佳量脂质体、报告质粒pSV-lac Z和pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)-X(本室构建)、pcDNA3.1(-)-X共转染COS-7, 检测β-gal的表达, 观察不同质粒对pSV-lacZ SV40启动子功能的影响[28,29].
1.2.5 抑制性消减杂交筛选流程 见文献[30]. 简言之, 以空白载体pcDNA3.1(-)和表达HBxAg的pcDNA3.1(-)-X分别转染HepG2细胞, 提取mRNA, 进行逆转录, 经过SSH的2轮杂交和2轮扩增, 获得差异表达的基因片段. 对于PCR扩增的差异表达基因片段进行TA克隆化, 对于阳性集落进行序列分析, 对于每一条基因片段的序列提交GenBank进行同源基因序列的搜索, 确认所得基因片段的独特性, 然后依据表达序列标签(EST)数据库中的同源基因片段进行电子拼接, 根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列, 确定完整的编码基因序列.
1.2.6 新基因的PCR扩增与序列分析 根据电子拼接序列的新基因序列, 设计新基因的序列特异性的引物, 利用从HepG2细胞来源的mRNA, 经过RT-PCR技术的扩增与克隆技术, 获得阳性克隆并进行序列分析.
的HBxAg基因约500 bp. 构建的中间载体pCR2.1-X用EcoRI单酶切, 电泳图谱为两条带: 500 bp(HBxAg基因片段)、3900 bp (pCR2.1空载体), 而以Hind III和Apa I双酶切所得基因片段定向插入pcDNA3.1(-)载体后, 酶切和DNA测序证实读码框架正确, 保证了其表达产物的正确性.
ELISA方法检测转染pcDNA3.1(-)-X的COS-7细胞裂解液的HBxAg蛋白, 结果为阳性.
以1.2 μg 3种质粒与0.3 μg报告质粒pSV-lac Z共转染COS-7细胞(2者以4:1的比例效果最佳), 脂质体用量6 μL. pcDNA3.1(-)-X实验组酶的表达是空质粒的4.5倍, 可见pcDNA3.1(-)-X明显促进β-gal的表达, 而pcDNA3.1(-)则无作用, 说明HBxAg对SV40启动子有反式激活作用, 增强pSV-lac Z基因的β-gal的表达.
经过对于转染细胞的差异表达基因序列的比较分析, 发现一段基因序列与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源.
新基因序列命名为XTP1, 在GenBank中的注册号AF488828, 基因序列的长度为1143 bp, 其中A为343、C为223、G为252、T为325, GC含量为42 %. XTP1基因序列及其编码产物如图1所示.
关于反式激活作用蛋白的靶基因及其作用的分子生物学机制研究, 近年来建立了一系列的技术和方法, 例如反式激活蛋白表达载体的构建、细胞转染技术, 结合基因表达谱的比较分析技术, 如消减杂交技术(subtractive hybridization)、任意引物差异显示逆转录多聚酶链反应(AP-DD-RT-PCR, arbitrary primer differential display reverse transcription polymerase chain reaction)、DNA芯片(DNA chip)、代表性差异显示分析技术(RDA, representative differential assay)以及抑制性消减杂交技术(SSH)等. 这些技术各有优缺点. 基因芯片技术的发展, 使高通量筛选的效率显著提高, 但是目前由于技术方面的原因, 选择的目的基因类型还只是人类基因组中所表达的基因的一小部分, 而且大部分基因只是功能已知的基因, 因此尽管基因芯片技术的应用具有广泛的发展前景, 但目前至少是选择的目的基因片段偏少、不利于克隆未知功能基因的研究. 经过多次改进的SSH技术也具有其他技术所不能比拟的优势, 经过2次均等化和2次杂交的SSH技术, 假阳性率得到了显著抑制, 并适合丰度较低基因的克隆化, 由于对于研究对象没有先决条件, 因此可能会筛选得到未知功能的新基因. 这是SSH技术的突出的优点所在[31-39]. 我们应用SSH技术对于反式激活作用蛋白的激活的靶基因进行克隆研究, 获得了成功. 不仅筛选到HBxAg反式激活作用的已知功能的基因, 同时还筛选到了HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因XTP1, 从而为HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制研究开辟了新的道路.
近年来肝炎病毒编码产物的反式激活作用得到了空前的重视. HBV基因组编码的X蛋白和羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBst), 以及丙型肝炎病毒(HCV)基因编码的核心蛋白、非结构蛋白3(NS3)、非结构蛋白5A(NS5A)等都已经得到证实具有反式激活作用. 但是这些蛋白的反式激活作用的特点和机制有所差别. Tu et al [40]首次发现X蛋白的反式激活功能, 由Vero细胞表达的X蛋白能够增强人干扰素β(IFN β)调控序列控制下的氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达. 后来的研究发现X蛋白主要作用于多种基因的增强子和启动子元件, 包括HBV的增强子和C基因的启动子、SV40早期增强子/启动子、多种病毒的长末端重复序列(LTR)、人IFN β基因调控序列, 对c-myc、人白细胞抗原(HLA)-DR、主要组织相容性复合体(MHC)-I及白介素8(IL-8)等都有反式激活作用.
对于乙型肝炎病毒的X蛋白功能域的分析阐明了HBxAg结构与功能之间的关系. 研究认为至少有一个位于103-117 aa的功能域对其作用非常重要. N末端和C末端对其反式激活都不重要, 认为转录活性区位于32-148 aa内, 105-148 aa区富含负电荷, 是其他反式激活因子的典型激活功能域所具有的特征; 32-66 aa区可能为结合功能域. Takada et al认为C末端134-139 aa(LGGCRHK)较保守, 缺失后X的反式转录活性几乎完全丧失. Arima et al [8]认为有3个关键功能域: 第46-52 aa(尤其是Pro-46、His-49、His-52), 第61-69 aa(尤其是Cys-61、Gly-67、Pro-68、Cys-69), 第132-139 aa(尤其是Phe-132、Cys-137、His-139), 这3段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守, 第1段序列形成组氨酸/天冬氨酸功能样特征, 第2与第3段序列与Kunitz样丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz功能区高度同源. N末端的5-27 aa或C末端143-154 aa缺失, 对X蛋白活性没有影响. 但也有相互矛盾的结果, 可能是X蛋白在不同细胞通过不同因子或途径起作用而导致所需的功能域不同所致[41-44]. X基因编码蛋白反式激活作用的特点: (1)X蛋白是非特异性的反式激活因子, 其作用具有广谱性. 来源于许多细胞的X蛋白都具有反式激活作用, 如人正常细胞或癌细胞、肝源性或非肝源性细胞, 以及其他哺乳动物细胞, 甚至昆虫或大肠杆菌等. 其激活的靶基因也有多种. (2)X蛋白是对自己或异源基因的增强子或启动子作用, 促进转录起始作用. (3)在同一细胞X蛋白对顺式元件似乎有相当的特异性, 当顺式元件不同时, 其反式激活作用相差悬殊. 而且X蛋白的作用具有时间依赖性. (4)X蛋白的作用显示出细胞依赖性, 仅有很少启动子在任何 细胞中都能被反式激活[45-47].
乙型肝炎病毒对于肝细胞的作用机制包括对于Ras-Raf-MAPK信号转导途径的影响. Ras是目前所知最保守的一族膜相关的G结合类癌基因, 对细胞生长、增生、发育、分化及癌细胞产生起重要作用. 编码产物Ras是一大族小的单聚体GTP/GDP结合蛋白, 因为Mr 21 000 Da, 因而也称之为p21. 结合GTP为活性状态, 结合GDP为非活性状态.研究表明[48-50], 培养细胞中HBxAg的表达可刺激Ras-GTP复合物的形成, 提示HBxAg与Ras信号途径存在一定的关系. 现在普遍认为, HBxAg反式激活通过2种模式起作用, 第1种模式, 认为HBxAg通过与DNA结合蛋白的结合激活大量转录因子和(或)激活转录的基本元件. 随着对HBxAg研究的深入, 另1种模式被越来越多的学者重视, 即认为HBxAg的反式激活是通过刺激细胞内信号转导途径而起作用. 在此模式里HBxAg可以激活大量的转录元件, 包括AP-1(activitor protein 1, c-Jun/c-Fos)、AP-2、AP-3、CRE(cyclic adenosine monophosphate response element)、SRE(serum response element)、NF-κB(nuclear factor κB) 、Oct-1等. 其中研究比较多的是HBxAg对AP-1和NF-κB的激活[51,52].
研究发现, 在转染细胞中HBxAg表达可以诱导Ras-GTP复合物的形成以及有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)的活化, 从而通过Ras-MAPK 途径激活转录因子. 这一激活可因转染细胞Ras和Raf的显性负突变(dominant negative mutant)而阻断, 而与蛋白激酶C(PKC)抑制剂的存在无关. 进一步研究发现, 由HBxAg刺激合成的Ras-GTP复合物可通过激活Raf转换其上游活化信号, 促使其下游元件发生磷酸化. Raf一旦被活化, 就作为MAPKKK(MEKK)将MAPKK(MEK)磷酸化而激活, MEK活化后进而使MAPK磷酸化而活化, 活化的MAPK可以使包括AP-1、AP-2和NF-κB在内的多种转录因子活化, 促进转录的发生. 通过HBxAg刺激Ras活化机制的研究, 发现HBxAg激活Ras途径是通过HBxAg作为Src家族的酪氨酸激酶的胞质内激活剂, 而诱导Ras上游的激活蛋白Shc、Grb2、SOS的联系, 同时在不改变Ras特殊的GTP酶激活蛋白活性的情况下, 使GTP和Ras结合, 但HBxAg本身并不参与复合物的形成. 例如v-Src介导强烈的Shc酪氨酸磷酸化, 引起与Grb2的联系及Ras信号途径的激活. 同样的c-Src可诱导Shc酪氨酸磷酸化, 进而导致Shc与Grb2结合, 最终激活Ras. HBxAg在不含血清的NIH 3T3细胞能强烈刺激Src家族激酶, 从而激活整个Ras途径. 最近的研究表明, HBxAg还可直接通过激活Src酪氨酸激酶启动一个高水平的病毒复制, 其机制是HBxAg在细胞中通过Src介导的途径刺激病毒前基因组mRNA逆转录为cDNA所致[53].
研究报道HBxAg能促进NF-κB依赖的转录活性, NF-κB为P50/P65或P52/P65组成的二聚体, 在生理条件下, 胞质中存在许多NF-κB抑制因子, 包括IκBα、IκBβ、BCL-3、NF-κB1蛋白前体(P105)等. HBxAg可促进IκB降解以及RelA从NF-κB 1蛋白前体中释放出来, 从而使NF-κB的活性得以发挥. 并且抑制Ras活性可阻止对NF-κB 激活. 同时发现HBx并不与NF-κB直接发生作用, 说明HBx 对NF-κB 的激活可能是通过Ras途径完成的. 但也有与此相矛盾的报道, 认为HBxAg与其他NF-κB诱导剂肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)等作用机制不同, 其刺激NF-κB 抑制剂IκB降解并不依赖Ras、Raf-1、PKC的活化, 推测可能与其他机制有关[54-56].
HBxAg可通过活化MAPK方式诱导AP-1, 控制AP-1 活化的MAPK方式有两种, 一种是细胞外信号调节激酶(ERKs), 为依赖Ras的一种c-Fos的重要激活剂. 另一种MAPK是c-Jun N末端蛋白激酶(JNKs), 功能是使c-Jun N末端磷酸化. 较早的资料表明, Ras激活ERKs是通过Raf途径完成的, 而JNKs的活化是由MEKK-1控制的, 由Ras -MEKK-1途径可介导中等水平的JNKs活化, JNKs活化以及c-Jun N末端磷酸化被认为在c-Jun合成过程形成一个正性自动调控圈. 因此认为HBx诱导AP-1可能通过两个途径完成, 一是通过依赖Ras的ERKs刺激c-Fos的合成, 另一条途径是活化JNKs使 c-Jun N末端磷酸化进而诱导c-Jun的大量合成. c-Fos和 c-Jun是构成AP-1的两个亚单位, 他们的大量合成是AP-1活化的基础. AP-1直接结合特异序列的AP-1启动子上游反应元件, 使转录水平上调, 完成信号转导[56-58].
HBxAg激活Ras信号转导途径还被认为与HBxAg激活RNA聚合酶III转录tRNA有关.研究发现HBxAg可刺激细胞内TATA结合蛋白(TBP)增高[59]. 另外, 相关的研究资料也提出, 表达HBxAg基因的细胞TBP mRNA的水平可稳定增高, 该研究还证明, HBxAg通过Ras/Raf-1信号途径的激活可刺激TBP启动子的转录. TBP是转录因子IIIB(TFIIIB)复合物的亚单位, 为细胞基因转录所需的转录因子, 可控制RNA聚合酶III的转录, 即TBP增高可使RNA聚合酶III活性增强. 通过分析依赖RNA聚合酶基因启动子和Copia启动子的表达以及TBP水平的检测, 表明HBxAg介导依赖RNA聚合酶III的反式激活及其增加细胞内TBP水平的能力有赖于Ras的活化. 进一步研究表明, 通过HBxAg介导的Ras刺激依赖RNA聚合酶III的基因可发生于各类细胞而不受细胞类型的限制. RNA聚合酶III主要负责tRNA 和5S RNA的转录, 被认为是维持细胞旺盛生长的必需因子, 例如猴病毒促进细胞转化的基本特征之一是tRNA的合成显著上升, 因此认为, HBxAg促进RNA聚合酶III转录活性可能与其致癌有一定关系. HBxAg也可反式激活依赖RNA聚合酶I的启动子, 该启动子负责28 S、18 S、5.8 S rRNA的转录合成, 而HBxAg诱导RNA聚合酶I基因的活性也是由Ras的激活所介导[60-63].
HBxAg可通过Ras途径刺激细胞周期的进程, 使细胞从G0期进入S期至少缩短12 h. 增强细胞通过G0/G1和G2/M检查点(checkpoint)控制, 从而促进细胞的增生[64].
此外, HBxAg蛋白具有的另外的一些特性也许有助于人们对其作用机制的进一步了解. HBxAg蛋白能进入细胞转录因子CREB和ATF-2的蛋白-蛋白复合物中, 扩展这些调节蛋白的DNA结合特异性, 这也可能是HBxAg蛋白参与转录调节的一种机制. 在大肠杆菌中表达的HBxAg蛋白对人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的LTR所引导的转录有反式激活作用, 并发现此蛋白具有内源性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性.研究发现HBxAg蛋白与V-abl及小鼠c-abl基因座编码的p18蛋白同源, 而此蛋白具有酪氨酸激酶活性, 从而提出了HBxAg蛋白通过共价修饰细胞因子或酶而引起激活的机制. 对HBxAg蛋白的分析还发现他具有Kunitz型的丝氨酸蛋白酶抑制子的Kunitz功能域顺序. 此顺序的突变导致反式激活作用的完全丧失, 因此HBxAg蛋白与这种抑制物或其同类物相似, 可与丝氨酸蛋白酶自然的抑制子竞争, 结合肝细胞来源的特异的丝氨酸蛋白酶, 从而扰乱细胞内转录因子的蛋白水解途径, 而执行其反式激活作用. 由此可见HBxAg蛋白激活途径的多样性[65-70].
需要强调的是, 目前对HBxAg反式激活的研究结果也存在不一致性, 甚至有矛盾的结果. 因为研究大多数采用瞬时表达系统, 将含有X基因的表达载体与报告基因载体用共转染实验. 分析其原因可能包括: (1)体外细胞培养研究单个病毒蛋白的孤立的效应可能与体内整体细胞蛋白的效应不同, 因为体内多种病毒蛋白可能具有协同或拮抗作用; (2)转染细胞中蛋白表达水平也会影响观察到的效应, 体外试验中目的蛋白都是过表达, 而病毒蛋白, 尤其是HBxAg蛋白在患者体内水平通常很低; (3)不同的细胞类型将有不同的应答; (4)细胞培养环境不可能完全真实地反映活体内环境; (5)应用报告基因瞬时转染观察的效应不可能完全模拟病毒蛋白对内源性细胞基因的作用[71-75].
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