病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1107-1113
Published online 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1107
乙型肝炎病毒x蛋白激活基因1的克隆化与序列分析
刘妍, 成军, 王琳, 王建军, 陆荫英, 李克
刘妍, 成军, 王琳, 王建军, 陆荫英, 李克, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
刘妍, 女, 1973-01-15生, 辽宁省海城市人, 满族, 1995年北京医科大学毕业, 军事医学科学院免疫学专业2002级硕士学位研究生, 助理研究员. 主要从事肝炎病毒的分子生物学与病毒性肝炎的发病机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
Abstract
目的

利用分子生物学技术, 研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用, 克隆HBxAg反式激活作用的靶基因, 为进一步探索HBxAg的反式激活作用, 以及反式激活作用的靶基因, 阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制, 为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.

方法

利用聚合酶链反应(PCR)技术, 扩增HBxAg的编码基因, 构建表达载体pcDNA3.1(-)-X, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA, 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析. 对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索, 确认为与已知的功能基因无同源性之后, 利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对, 进行电子拼接, 完成新基因序列的确定. 然后自HepG2细胞提取总mRNA, 应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物, 进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增, 获得阳性克隆之后, 进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.

结果

PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列, 经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误. 转染HepG2细胞并提取足量的mRNA, 利用SSH技术进行分析, 获得的基因片段序列分析结果表明, 其中之一为新型基因片段序列, 与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性. 通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对, 电子拼接成功, 根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列, 确定新型基因序列. 从HepG2细胞提取总mRNA, 以RT-PCR技术, 扩增获得该新基因的全基因序列, 并测序证实, 命名为XTP1, 在GenBank中注册, 注册号为AF488828.

结论

利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合, 发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1, 并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

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