病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 935-938
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.935
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究
成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚
成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
成军, 男, 1963-08-17生, 山东省淄博市人, 汉族. 1986年毕业于第一军医大学军医系, 获医学学士学位, 1989年毕业于军医进修学院, 获传染病学硕士学位, 1994年毕业于北京医科大学, 获传染病学博士学位, 1994-11-17/1997-12-01在美国得克萨斯大学健康科学中心临床免疫与传染病科完成博士后研究, 教授, 主任医师. 现任中华医学会传染病与寄生虫病学分会副主任委员、中华医学会热带病与寄生虫病学分会全国常委、全军医学科学技术委员会传染病与寄生虫病学会委员. 目前从事传染病特别是病毒性肝炎的临床医疗工作和基础研究工作, 学术研究方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制, 已出版专著5部, 发表论文及综述300篇.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No.C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15

目的

丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质. 为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因, 我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析. 研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.

方法

根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物. 以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板, 进行多聚酶链反应(PCR)扩增, 将获得的HCV NS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A. 以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总RNA, 逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析. 应用分子生物学技术, 结合生物信息学技术(bioinformatics), 克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.

结果

构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A, 经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误. 以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA, 逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析. 应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因, 命名为NS5ATP10, 新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt), 编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.

结论

HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白. 微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术. 发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因, 这一发现, 为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制, 开辟了新的研究方向.

关键词: N/A
引文著录: 成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚. 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 935-938
Identification and characterization of gene 10 transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A with DNA microarray assay
Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Lin Wang, Yan-Wei Zhong, Jing Dong, Gang Wang
Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Lin Wang, Yan-Wei Zhong, Jing Dong, Gang Wang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. C03011402, No. C30070689.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuan Zhonglu, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: January 11, 2003
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003

AIM

To explore the new target genes transactivated by HCV NS5A, we conducted microarray assay on the hepatoblastoma HepG2 and HepG2 transfected by NS5A expressive vector.

METHODS

Sequence specific primers were designed and synthesized according to the HCV-H strain of virus sequence. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to amplify the NS5A coding gene for the construction of expressive vector pcDNA3.1(-)-NS5A. Hepatoblastoma cell line HepG2 was transfected with plasmid DNA of pcDNA3.1(-)-NS5A, and total RNA was purified from it. Reverse transcribed cDNA were subjected to microarray assay. The coding gene transactivated by HCV NS5A was cloned by bioinformatics methods.

RESULTS

The expressive vector had been constructed and approved correct. The RNA had been purified from HepG2 and HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-NS5A, respectively. The cDNA derived had been subjected to microarray assay. New gene named NS5ATP10 had been cloned in combination of molecular biological and bioinformatics methods.

CONCLUSION

HCV NS5A is a potential transactivator. Microarray is an efficient and convenient method for analysis of differentially expressed genes. A new gene has been recognized as the new target transactivated by HCV NS5A protein. These results pave the way for study on the transactivation of HCV NS5A protein.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是一种RNA病毒, 属于黄病毒属, 基因组含有唯一的开放读框(ORF), 可以分成结构基因区和非结构基因区[1-4]. 在生活周期中, 首先翻译成3010左右个氨基酸残基(aa)组成的多肽, 然后在自身蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的共同作用下裂解成不同的结构和非结构蛋白. HCV非结构蛋白5A(NS5A)即为非结构蛋白的一种[5-8]. 几年来的研究表明, HCV NS5A蛋白具有多种生物学功能. 在某些地区, 特别是在日本等地区, 发现NS5A序列的异质性(heterogeneity)是影响干扰素α(IFNα)治疗敏感性的决定因素, 即HCV NS5A区存在着一段特殊的核苷酸序列, 称为干扰素敏感决定区(ISDR, interferon sensitivity determinant region). 近年来的研究结果还证实, NS5A蛋白还具有结合载脂蛋白AI、AII的功能, 在肝脏脂肪滴中也见到了NS5A的存在, 因此, 认为NS5A蛋白在慢性丙型肝炎肝脏脂肪变(steatohepatitis)的发病中也有重要地位[9-16]. 不同磷酸化形式的NS5A蛋白具有反式激活作用也是目前关于NS5A生物学功能研究的热点, 推测NS5A蛋白的这种反式激活作用, 可能是HCV感染与肝细胞癌(HCC, hepatocellular carcinoma)发生发展密切相关的重要的分子生物学机制[17-19]. 我们应用微矩阵技术, 对于NS5A表达载体转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2的基因表达谱变化进行比较研究, 发现了NS5A蛋白的反式激活靶基因. 其中包括未知功能基因, 命名为NS5ATP10.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109为本室保存, pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司; Lipofectamine PLUS转染试剂购自Gibco公司, mRNA Purification试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech, PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×CR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒购自Clontech, High Pure PCR Product Purification试剂盒购自Boehringer Mannheim公司, T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体购自Promega公司. 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A由本室构建. DNA序列测定由上海博亚公司完成.

1.2 方法

1.2.1 丙型肝炎病毒NS5A蛋白基因表达载体的构建 根据HCV-H病毒株的基因序列设计、合成序列特异性引物, 以含有全长HCV-H株的cDNA质粒(Rice CM, Rockfeller University, USA)作为模板, 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5A的全长编码基因. 先克隆到TA载体中进行序列测定, 然后再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.

1.2.2 细胞培养和转染 肝母细胞瘤细胞系HepG2以完全DMEM培养基培养. 转染时, 前1 d传代的细胞, 控制在75%的融合度, 以Lipofectamine PLUS试剂进行转染, 表达质粒载体DNA的用量为2 μg. 转染48 h之后收获细胞.

1.2.3 总RNA的提取和逆转录 从转染和未转染的HepG2细胞系提取总RNA, 并进行逆转录.

1.2.4 微矩阵分析 利用联合基因公司开发的基因芯片技术系统进行分析.

1.2.5 未知功能基因序列的确定 从基因芯片技术分析的结果中发现一未知功能基因, 在转染pcDNA3.1(-)-NS5A的表达载体质粒后显著上调, 以生物信息学技术对于其编码基因序列进行确定.

2 结果
2.1 真核表达载体的鉴定

真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列的测定, 证实正确无误.

2.2 细胞转染和RNA的提取、逆转录

应用上述技术流程, 获得总RNA 3.2 μg, 并进行标准程序的逆转录.

2.3 基因芯片技术分析

应用联合基因公司开发的基因表达谱技术分析, 证实HCV NS5A蛋白的表达, 对于一系列的已知功能基因和未知功能基因具有反式调节作用, 其中对一些基因的表达具有显著的上调作用, 对另一些基因的表达具有显著的下调作用. 在显著上调的基因序列中包括未知功能基因, 我们将其命名为NS5ATP10.

2.4 HCV NS5A反式激活靶基因的基因序列和编码产物序列

HCV NS5A反式激活靶基因的基因序列和编码产物序列如图1. 编码基因序列全长为717个核苷酸(nt), 编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.

图1
图1 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A蛋白反式激活靶基因10基因序列及编码产物一级结构序列.
3 讨论

病毒基因组的复制和表达调节与真核细胞类似, 主要是转录水平的调节. 在许多情况下, 病毒这种简单的生物类型, 还必须借助感染的宿主细胞的一些复制和表达的辅助元件完成其生活周期及致病过程. 因此, 病毒的基因表达调节与真核细胞一样, 主要是转录水平为主的多水平的调节机制. HCV的表达调节也不例外. 转录水平的调节根据调节的机制和参与的因素不同, 可以分成顺式(cis)调节和反式(trans)调节2种. 所谓的顺式调节就是分子结构内部的调节, 例如基因启动子序列对于转录基因的转录活动的调节, 增强子基因序列对于启动子转录活性的调节都属于此类. 所谓的反式调节就是分子之间表达调控的调节方式, 例如, 具有DNA结合功能的转录因子核蛋白对于启动子转录活性的调节等就属于此类. 反式调节的结果, 从调节靶点的效果来看可以分成2类: 上调(up-regulation)和下调(down-regulation). HCV感染肝细胞之后, 也存在复杂的反式调节作用[20-26]. 从参与的反式调节的因素来看, 可以分成病毒对病毒的反式调节、病毒对于肝细胞蛋白编码基因的反式调节、肝细胞蛋白对于病毒基因表达的反式调节等几种不同的情况. 我们经常看到不同病毒之间存在的反式调节的研究报道. 肝细胞核因子(HNF, hepatocyte nuclear factor)系列是肝细胞中特有的转录因子蛋白, 与肝炎病毒基因启动子DNA之间的结合和对病毒基因的转录调控是肝炎病毒相对嗜肝特点的主要决定因素之一. 肝炎病毒蛋白作为一类反式激活因子, 常常改变肝细胞中细胞周期(cell cycle)、细胞凋亡(apoptosis)、细胞分化(differentiation)、信号转导(signal transduction)等的相关基因的表达, 在肝炎病毒的致病性和肝细胞癌的发生发展中具有十分重要的作用和意义[27-36].

丙型肝炎病毒的NS5A蛋白是一种具有广泛反式激活作用的蛋白质分子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征. 一般来说, 转录的反式激活因子是在细胞核中起作用的, 而NS5A主要定位于细胞内质网(ER), 因此推测NS5A可能参与了细胞信号转导途径. 尽管已有明确证据显示NS5A蛋白全长定位于细胞质内, 在细胞核内仍可以检测到NS5A的N-末段的定位信号[37-40], 这就提示这部分结构可进入细胞核内并成为转录激活因子的一部分. 最近的研究表明缺失N-末段146 aa和DNA结合区域在GAL4(一种酵母细胞转录激活因子)的HCV NS5A蛋白可强烈的激活酵母和哺乳动物细胞的转录活性. 结合到GAL4 DNA结合区域的全长的HCV NS5A蛋白并没有激活转录的作用, NS5A片段转录激活作用最强的位点定位于2135和2331 aa之间. NS5A的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区(2143-2184 aa, 2220-2273 aa)和一个脯氨酸富集区(2282-2327 aa). 酸性氨基酸区的酸性氨基酸残基的数量与NS5A的反式激活活性相关, 2个酸性氨基酸区是NS5A的转录激活作用的核心区域, 因此酸性氨基酸区2的一些氨基酸的突变可明显影响NS5A的转录激活作用, 但是这些突变更多的是引起蛋白的二级结构的改变. 脯氨酸富集区被认为对NS5A的转录激活作用只有一定的加强作用, 相对而言并不特别重要.

Gong et al研究发现, NS5A能够反式激活核转录因子NF-kB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用. NS5A在细胞质内通过氧化应激作用激活NF-kB和STAT-3转录因子. NS5A引起细胞内钙离子的紊乱. Ca2+作为第二信使激发线粒体内的活性氧簇的水平, 使NF-kB和STAT-3易位至细胞核内. 有证据表明STAT-3的激活部分有NS5A的作用. 在抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或者Ca2+拮抗剂(EGTA-AM, TMB-8)作用下, NS5A诱导的NF-kB和STAT-3的反式激活作用消失了. 这些结果说明了NS5A可引起细胞内与病毒感染相关的病理改变的发病机制. Ghosh et al研究发现, NS5A蛋白能够抑制细胞周期调节基因p21WAF1的表达, HCV NS5A对于p21WAF1表达的抑制, 实际上就是对于细胞周期的促进作用. HCV NS5A对于细胞周期的调节作用还表现在激活人肝癌细胞中增生细胞核抗原(PCNA)基因, 从而调节细胞凋亡, 促进细胞增生. 研究证实, 将HCV NS5A导入到小鼠成纤维细胞NIH 3T3中, 可以导致其贴壁非依赖性生长以及获得在裸小鼠体内形成肿瘤病灶的能力. 这些都是HCV NS5A通过反式激活作用对于靶细胞中细胞周期调节机制干扰的结果, 可能是HCV感染致肝细胞恶性转化的重要机制之一.

本项研究中发现了HCV NS5A蛋白反式激活的新的靶基因, 为研究HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其后果提供了新的研究方向和研究思路. 由于目前对于新克隆的NS5A蛋白反式激活的靶基因的结构与功能、表达与调控, 以及新基因的生物学作用和在丙型肝炎致病机制中的作用和地位不明, 需要进一步研究, 以阐明新基因的研究意义.

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