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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究
成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
成军, 男, 1963-08-17生, 山东省淄博市人, 汉族. 1986年毕业于第一军医大学军医系, 获医学学士学位, 1989年毕业于军医进修学院, 获传染病学硕士学位, 1994年毕业于北京医科大学, 获传染病学博士学位, 1994-11-17/1997-12-01在美国得克萨斯大学健康科学中心临床免疫与传染病科完成博士后研究, 教授, 主任医师. 现任中华医学会传染病与寄生虫病学分会副主任委员、中华医学会热带病与寄生虫病学分会全国常委、全军医学科学技术委员会传染病与寄生虫病学会委员. 目前从事传染病特别是病毒性肝炎的临床医疗工作和基础研究工作, 学术研究方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制, 已出版专著5部, 发表论文及综述300篇.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No.C30070689 ; 军队"九、五"科技攻关项目 , No. 98D063 ; 军队回国留学人员启动基金项目 , No. 98H038 ; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目 , No. 01Q138 ; 军队"十、五"科技攻关面上项目 , No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15
修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15
Abstract
目的
丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质. 为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因, 我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析. 研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.
方法
根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物. 以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板, 进行多聚酶链反应(PCR)扩增, 将获得的HCV NS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A. 以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总RNA, 逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析. 应用分子生物学技术, 结合生物信息学技术(bioinformatics), 克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.
结果
构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A, 经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误. 以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA, 逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析. 应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因, 命名为NS5ATP10, 新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt), 编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.
结论
HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白. 微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术. 发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因, 这一发现, 为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制, 开辟了新的研究方向.
Keywords: N/A