修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-18
在线出版日期: 2003-07-15
病毒性肝炎的发病机制中涉及到复杂的反式调节(trans-regulation)机制. 肝炎病毒的反式调节机制至少包括三方面的含义: 一方面是肝炎病毒蛋白对于肝细胞基因组表达调节的反式调节, 即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合, 对于肝细胞基因表达谱产生影响; 第二方面是肝细胞蛋白对于肝炎病毒基因表达的反式调节. 肝炎病毒属于简单的生物类型, 要完成其生活周期, 必须借助于肝细胞中的蛋白成分, 肝细胞中特有的一些蛋白成分, 与肝炎病毒基因组DNA/RNA结合, 对于肝炎病毒基因表达进行调节, 这也是决定肝炎病毒嗜肝特性的重要的分子生物学机制; 第三方面是肝炎病毒蛋白对于肝炎病毒基因组表达的反式调节. 这是所有病毒复制和表达调节的一般机制. 关于肝炎病毒反式调节机制的研究, 主要是阐明肝炎病毒为何在肝细胞中的复制和表达处于最佳状态, 阐明肝炎病毒的致病机制, 有助于据此设计新型的抗肝炎病毒的治疗技术和治疗方法.
引文著录: 成军. 病毒性肝炎发病机制中的反式调节机制. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 888-896
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 18, 2003
Published online: July 15, 2003
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(7): 888-896
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i7/888.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i7.888
基因表达的调节方式分为顺式(cis)调节和反式(trans)调节, 肝炎病毒基因表达的调控也不例外. 分子结构内部的基因表达调节元件的作用形式称为顺式调节, 而分子间的基因表达调节元件的作用形式称为反式调节. 例如, 肝炎病毒基因启动子对于本身下游编码基因的转录表达的调节就属于分子内部不同部分之间的调节, 称为顺式调节; 而与肝炎病毒DNA/RNA结合的肝炎病毒蛋白、肝细胞蛋白对于肝炎病毒基因表达的调节则称为反式调节. 肝炎病毒与哺乳动物细胞的基因表达调节的机制相类似, 主要是转录水平的反式调节机制. 乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)虽然分属于DNA病毒和RNA病毒, 但是, 这两种肝炎病毒的基因复制和表达均存在复杂的调节机制, 其中反式调节机制是重要的组成部分[1]. HBV基因编码的蛋白除了与自身的基因组DNA/RNA结合并进行调控之外, 某些肝炎病毒的蛋白如HBxAg、截短型表面抗原中蛋白(MHBst), HCV基因编码的核心蛋白、NS3蛋白、NS5A蛋白等都具有显著的肝细胞靶基因的反式调节功能[2-4]. 同时, HBV的DNA、RNA以及HCV RNA等调节基因区等都有肝细胞蛋白的结合位点, 肝细胞蛋白与这些调节基因之间的结合, 调节这些肝炎病毒的基因表达与转录, 也是决定这些肝炎病毒均具有一定程度的嗜肝特性的分子生物学机制[5,6].
HBV基因表达的精确调节是HBV DNA复制过程中的必须环节. HBV的基因组是在前-C/基因组启动子(CP)、表面抗原基因启动子SP I、SP II和X基因启动子(XP)的分别调节作用下进行的. 除了SP I之外, 其他的所有启动子DNA序列都缺乏典型的转录起始复合物典型的TATA盒式结构, 因此代表了一类特殊类型的启动子序列结构. 在HBV DNA序列之中, 还存在着2段启动子序列和一些负性调节元件, 提示HBV DNA的复制过程受到严密的调控. 所有这些顺式调节元件都包埋在基因组的编码基因序列之中, 说明HBV DNA是一种紧密结构, 最大程度地利用了较小的基因结构, 发挥最大的调节功能, 利用率之高, 实为罕见. HBV DNA的这些调控元件也都是肝细胞特异性的, 这也是决定HBV嗜肝特性的重要的分子生物学机制. HBV基因编码的一些蛋白对于HBV DNA/RNA的结合与调节是HBV反式调节机制中重要的内容和组成部分[7]. HCV的基因表达调节也是如此, 5'-非翻译区(5'-NTR)和3'-非翻译区(3'-NTR)的RNA序列, 是关于HCV复制和表达的关键的基因结构序列. HCV的5'-NTR可以折叠成为4段茎环(stem-loop)结构, 主要与HCV RNA的复制过程的调节有关, 3'-NTR则主要与HCV RNA的复制过程有关. 肝炎病毒蛋白的结合实现其自身的反式调节机制.
HBV DNA的复制与逆转录病毒的复制过程不同, 不需要有核苷酸片段作为引物, 可直接从称为ε(epsilon)元件的RNA茎环结构开始合成全新的HBV RNA分子. 从ε开始合成一小段DNA, 与P蛋白共价相连, 然后合成就停止. 起始位点的选择和合成停止的信号就包含在P蛋白/ε元件形成的复合物中. 因为P蛋白的活性是细胞分子伴侣依赖性的, 因此利用体外兔网织红裂解物进行鸭HBV DNA P蛋白的体外翻译, 也可以形成这种复合物. 根据共价结合的鸭HBV DNA P蛋白的标记, 可以研究引物合成过程中εRNA元件的功能. 应用这一体外系统, 结合一系列的RNA-DNA突变体, 发现在第57个核苷酸茎-环结构的5个核糖基团才是功能性模板, 模板区只有一个残基, 在低位的茎结构的顶端有2个碱基, 都是基本结构的组成部分. 2'-OH-基团的存在以及起始位点稍下游碱基性质包含起始位点的选择和合成停止的信号. 具有复制功能的嗜肝病毒核心颗粒的装配需要核心蛋白、聚合酶与病毒前基因组中包装信号ε之间的相互作用. 核心蛋白N-末端部分(aa 1-149)可以自发地装配成核壳结构, 而C-末端部分(aa 150-183)可与前基因组RNA结合. Waris et al[8]构建了2种HBV核心蛋白的突变体(C144Arg和C144Lys), 其C-末端的SPRRR(Ser-Pro-Arg-Arg-Arg)基序以精氨酸或赖氨酸残基替换, 以研究这一基序在前基因组装配和病毒成熟中的作用. 以表达突变或野生型核心蛋白的表达质粒与缺失核心蛋白编码区的质粒共转染人肝癌细胞系HuH-7, 研究反式互补对于病毒复制效率的影响. 在所有共转染的细胞质中, 都存在密度有差别的核颗粒, 但由C144Arg和C144Lys突变体构成的核颗粒由于缺乏内源性的聚合酶活性, 不能修复HBV DNA. 另外, 以pHBVC144Arg或pHBVC144Lys与产生具有复制功能的核颗粒的质粒进行共转染, HBV DNA的修复信号下降40-80倍, 这是因为野生型与突变型结合形成的嵌合体, 对于HBV DNA修复功能的影响. 提示位于核心蛋白C-末端的SPRRR基序对于HBV DNA的复制和成熟非常关键.
乙型肝炎病毒基因组编码的蛋白作为反式激活因子, 对肝细胞某些基因表达调控的影响, 可能是HBV致癌的主要因素. 早期研究多集中在整合的病毒DNA编码的HBxAg蛋白的功能上, 证实HBxAg蛋白是一种具有广泛活性的反式激活因子, 对乙型肝炎的慢性化和促进肝细胞的恶性转化有密切关系; 近年研究发现, 从肝癌细胞系或肝癌组织中亚克隆出的截短型前-S2/S基因表达产物羧基末端的截短型分子MHBst也具有反式激活功能. 我们构建了一种含有约500 bp MHBst167基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt, 该基因编码的MHBs 167位氨基酸残基以后的羧基末端截短. pcDNA3.1(-)-Mt瞬时转染COS-7细胞, 用前-S2单克隆抗体检测到截短型蛋白MHBst167的表达, 并且1:32倍稀释还可检测到MHBst167蛋白阳性. 与报告质粒pSV-lacZ共转染COS-7细胞, 明显促进β-gal的表达, 证明pcDNA3.1(-)-Mt能增强pSV-lacZ的SV40启动子的功能, 编码的MHBst167是一种反式激活因子, 而全长的MHBs无此功能[9,10].
目前研究表明, MHBst的反式激活效应可能与蛋白激酶C(PKC)依赖的信号转导途径有关, 前-S2区域与PKCα/β结合发生磷酸化反应, 触发PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导链式反应, 结果激活了转录因子如AP-1、NF-κB、AP-2、SRE、Sp1和c-myc、c-fos启动子, 参与病毒感染后的炎症反应和肝细胞癌的发生. MHBst蛋白结构的改变, 缺失了位于C-末端的膜定位信号, 使MHBst在未能进入分泌途径而在内质网(ER)中滞留, 其前-S2区指向胞质区与胞质蛋白相互作用, 产生转录激活功能; 而全长的MHBs蛋白的前-S2区指向ER腔, 进入高尔基复合体而分泌. 所以说MHBst的反式激活功能依赖于其N-末端前-S2区的胞质定位功能. 而缺失突变的范围是决定该截短型分子是否具有反式激活作用的重要影响因素, MHBst至少完全缺失蛋白C-末端S区的疏水区III, 才具有反式激活功能; S区的N-末端疏水区I是反式激活所必需的, 因为蛋白与膜的结合是转录激活功能所必需的, 这段序列被称为"反式活性开启区"(trans-activity-on region, TAO). 进一步研究表明, MHBst 的最小反式激活单元定位于4-53氨基酸残基, MHBst53是其中最小的转录激活因子, 是一种非膜结合类型的MHBst, 就是说, 仅前-S2区(aa 1-55)就足以介导反式效应, 说明作为反式激活剂的MHBst大小范围是很大的. 我们目前正在构建不同截短范围的表达载体, 进一步研究MHBst的反式激活功能, 筛选和克隆其反式激活的靶基因[11,12].
慢性HBV感染者, HBxAg蛋白在HCC形成过程中具有十分重要的意义. Ogden et al[13]发现HBxAg的反式激活功能, Vero细胞中表达的HBxAg蛋白能够增强人干扰素β(IFN-β)调控序列控制下的氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达. 后来的研究发现HBxAg蛋白可作用于多种基因的增强子和启动子元件, 包括HBV的增强子和C基因的启动子、SV40早期增强子/启动子、多种病毒的长末端重复序列(LTR)、人IFN-β基因调控序列, 对c-myc、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、主要组织相容性抗原-I(MHC-I)及白介素-8(IL-8)等都有反式激活作用. 为了研究HBV感染者HBxAg蛋白在肝细胞恶性转化过程中的具体作用, Lee et al[14]构建了受四环素严格调控的HBxAg蛋白表达载体, 建立表达HBxAg蛋白的分化细胞系3pX-1和去分化细胞系4pX-1. 只有3pX-1细胞系有恶性转化的现象, 主要机制就是持续的Ras-Raf-MAPK系统的激活. 没有发生转化的4pX-1细胞系具有持续的JNK信号转导系统的激活. HBxAg蛋白在3pX-1和4pX-1细胞系中参与的信号转导通路是有差别的. 对于这2个细胞系的细胞周期参数进行比较研究, 3pX-1细胞系表现出HBxAg蛋白依赖性的G1、S和G2/M期的进展, 表现为细胞周期素D1、A和B1的表达水平升高, Cdc2激酶的激活等. 在4pX-1细胞系中可以见到HBxAg蛋白依赖性的G1和S期的进入, 之后是S期的停止, 缺乏Cdc2激酶的激活. 4pX-1细胞系表现出HBxAg蛋白诱导的细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p21(Cip1)、肿瘤抑制蛋白p19(ARF)、细胞凋亡蛋白bax以及胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达. 尽管出现了HBxAg蛋白诱导的生长停滞, 也没有Cdc2的激活, 但4pX-1细胞系并没有出现HBxAg蛋白依赖性G2/M阻滞或细胞凋亡.
HBV的HBxAg蛋白可以诱导Fas配体(FasL)的表达, 从而帮助肝细胞癌(HCC)细胞逃避宿主的免疫监视系统. Lee et al[15]研究了HBxAg蛋白诱导转录因子Nur77基因的表达. Nur77是细胞核内的一种孤生受体, 在FasL表达上调中具有重要作用. 以表达HBxAg蛋白的Chang X-34细胞系进行研究时, 发现HBxAg蛋白的表达可以诱导Nur77的表达. 将反义基因或者负显性突变体导入细胞中对于Nur77基因的表达进行阻断时, 可以显著阻断HBxAg蛋白对于FasL的基因表达的诱导. 说明Nur77在HBxAg蛋白诱导FasL的表达过程中具有重要的作用. 进一步的研究结果表明, 表达HBxAg蛋白的细胞系具有较高的Nur77转录水平以及DNA的结合能力, 说明Nur77在HBxAg蛋白诱导Fas/FasL信号转导过程中具有关键的调节作用.
HBxAg蛋白对于细胞基因表达的影响是十分广泛的, 这也是HBV相关的HCC发生发展的重要机制. 但是, 关于HBxAg蛋白的分子生物学作用机制, 大部分都是以肝癌细胞系作为细胞模型进行研究的, Nijhara et al[16]构建了转导正常肝细胞的有效基因转移途径, 结果表明, 这种基因转移技术可以使50%以上的细胞表达HBxAg蛋白. Tarn et al[17]证实HBxAg引起的肝细胞的恶性转化过程与RAS-RAF-MAPK和JNK信号转导途径有关. Kang-Park et al[18]证实HBxAg蛋白通过转录因子Sp1调节胰岛素样生长因子II(IGF II)启动子4的活性. 在这一调节系统中, PKC和p44/p42 MAPK是必须的. 首先, PMA对PKC的激活, 或者PKC的表达载体可以促进Sp1转录因子的磷酸化, 提高P4启动子的转录活性. PKC的抑制剂Go6976可以降低Sp1的磷酸化, 同时降低P4启动子的活性以及IGF-II mRNA的转录表达水平. MEK 激活抑制剂U0126降低Sp1的磷酸化水平, P4启动子活性和IGF-II mRNA转录表达水平下降. 这些结果说明PKC、p44/p42 MAPK信号转导通路是HBxAg通过Sp1介导的IGF-II基因激活的重要条件. Pflum et al[19]证实, HBxAg与CREB之间可以结合, 并且可以促进这种蛋白的DNA结合能力. HBxAg在反式激活靶基因转录调节的机制中, 需要Ser-133位点没有发生磷酸化修饰的CREB的参与. HBxAg可以上调Camp应答基因的表达, 说明在肝细胞的增生, 直至肝细胞的恶性转化过程中都有十分重要的作用. Park et al[20]对p53基因发生突变的Hep3B细胞系进行了研究, 以HBxAg表达载体进行稳定转化时, p21(waf1/cip1)mRNA转录和蛋白表达水平显著升高, 与CDK2结合的水平显著升高, 显著抑制了细胞周期素E和CDK2复合物的形成以及组蛋白H1的磷酸化修饰, p21启动子活性增强. 利用基因突变技术, 证实p21启动子在-1185和-1482 nt之间. 基因突变分析结果表明, HBxAg应答位点与ets因子结合位点重叠. 说明在这一细胞系中, HBxAg可以克服由于p53功能缺失造成的下游p21(waf1/cip1)表达调节的障碍.
HBxAg蛋白功能域的分析: Guo et al[21]认为至少有一个位于103-117 aa的功能域对其作用非常重要. Madden et al[22]结果显示, N末端和C末端对其反式激活都不重要, 认为转录活性区位于32-148 aa内: 105-148区富含负电荷, 是其他反式激活因子的典型激活功能域所具有的特征; 32-66 aa区可能为结合功能域. Shamay et al[23]认为C末端134-139 aa(LGGCRHK)较保守, 缺失后HBxAg的反式转录活性几乎完全丧失. Bouchard I [24]认为有3个关键功能域: 第46-52 aa(尤其是Pro-46、His-49、His-52), 第61-69 aa(尤其是Cys-61、Gly-67、Pro-68、Cys-69), 第132-139 aa(尤其是Phe-132、Cys-137、His-139), 这三段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守, 第一段序列形成组氨酸/天冬氨酸功能样特征, 第二与第三段序列与Kunitz样丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz功能区高度同源. N末端5-27 aa或C末端143-154 aa缺失, 对X蛋白活性没有影响. 但也有相互矛盾的结果, 可能是HBxAg蛋白在不同细胞通过不同因子或途径起作用而导致所需的功能域不同所致.
需要强调的是, 目前对HBxAg反式激活的研究结果也存在不一致性, 甚至有矛盾的结果. 因为研究大多数采用瞬时表达系统, 将含有X基因的表达载体与报告基因载体用共转染实验. 分析其原因可能包括: 体外细胞培养研究单个病毒蛋白的孤立的效应可能与体内整体细胞蛋白的效应不同, 因为体内多种病毒蛋白可能具有协同或拮抗作用; 其次, 转染细胞中蛋白表达水平也会影响观察到的效应, 体外试验中目的蛋白都是过表达, 而病毒蛋白在患者体内水平通常很低; 第一, 不同的细胞类型将有不同的应答; 第二, 细胞培养环境不可能完全真实地反映活体内环境; 最后, 应用报告基因瞬时转染观察的效应不可能完全模拟病毒蛋白对内源性细胞基因的作用.
丙型肝炎病毒核心蛋白是HCV基因组编码的一种结构蛋白, 具有多种生物学调节作用, 与JAK-STAT信号转导系统的调节有密切关系[25]. JAK-STAT信号转导系统是干扰素α(IFNα)和I型细胞因子广泛采用的信号转导途径. 这些细胞因子首先激活JAK激酶, 然后磷酸化和激活STAT蛋白. 在磷酸化和激活之前, STAT蛋白存在于细胞质之中, 激活之后就发生细胞内转位, 到达细胞核中, 对肝细胞基因组的表达进行调控. 研究发现, HCV抑制IFNα介导的JAK-STAT信号转导系统, 主要机制是阻断IFNα刺激的基因因子3(ISGF3)复合物的形成. 但是其下游的信号转导通路以及主要的HCV蛋白类型目前还不是特别清楚. Li et al[26]对HCV核心蛋白对于IFNα和干扰素γ(IFNγ)介导的JAK-STAT信号转导的影响进行了研究. HCV核心蛋白的表达对于IFNα诱导的STAT1表达具有显著的下调作用, 凝胶阻滞分析(gel retardation assay)表明表达HCV核心蛋白的细胞, 受到IFNα刺激后反式激活因子GAF和ISGF3的形成显著降低. 蛋白表达和RNase保护研究结果表明, GAF或ISGF3 形成能力的降低, 与STAT1蛋白表达水平的降低有关. 但这些信号转导途径的改变对于下游靶基因如IFNα调节因子-1(IRF-1)、561的表达没有显著影响. 以HCV结构和非结构基因稳定转染的细胞, 也有类似的效应, 原因不清楚.
为了研究HCV的恶性转化作用, Kim et al[27]建立了稳定表达HCV核心蛋白的BALB/3T3 A31-I-1细胞系, 这一细胞系在受到HCV核心蛋白与v-H-ras的基因共转染时, 就失去生长接触抑制, 发生形态学改变, 呈现非贴壁生长, 而且出现非血清依赖性生长的特点. 表达HCV核心蛋白的细胞系在受到生长因子的刺激以后, 生长速度显著加快. 另外, 以人工合成的反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)阻断细胞中HCV核心基因的表达, 对于其生长具有一定的抑制作用. HCV核心蛋白可激活MAPK和血清应答元件(SRE).
HCV的基因分型和HCV核心蛋白的一级结构序列对于其功能也具有十分重要的意义. Lee et al[28]研究证实HCV基因型1 a和3的核心蛋白对于MEK1和Erk1/2 MAPK都有激活作用, HCV核心蛋白持续表达可产生Raf1和MAPKK高基础水平的表达, 这种现象可以通过内源性Raf1活性的体外分析及高度磷酸化的Erk1 和Erk2的水平检测而得到反映, 甚至在血清饥饿状态下也存在这种现象. Erk1/2及其下游转录因子Elk-1的激活时间在细胞受到EGF的刺激以后显著延长. 尽管存在MAP磷酸酶MKP的反馈调节, 表达HCV核心蛋白的细胞在受到EGF的刺激后这种激活仍然存在, 可能与Raf-1的持续激活有关. HCV核心蛋白对于MAPK激酶链具有直接的激活作用, 这也是HCV核心蛋白对于细胞具有转化作用的机制之一. Ahn et al[29]建立了四环素控制的表达全长(191 aa)或部分序列(160 aa)的HepG2 细胞系. 发现HCV核心蛋白可以激活细胞外信号调节激酶(ERK)、c-jun N-末端激酶(JNK)、p38丝裂原激活蛋白(MAP)激酶、诱导MAP激酶磷酸酶MKP-1的表达, 并促进细胞的增生. 同时伴有c-jun和ATF-2的激活, 但没有Elk-1和c-fos的激活. 另外, AP-1的激活过程与c-fos的状态无关. 全长或截短型HCV核心蛋白具有相似的作用.
HCV核心蛋白对于细胞凋亡具有促进和抑制的双向调节作用, 主要决定于诱导细胞的刺激因素和当时细胞所处的状态. Tsuei I[30]研究了HCV核心蛋白对于血清饥饿诱导的细胞凋亡的影响进行了研究. 稳定表达HCV核心蛋白的NIH 3T3细胞系对于血清饥饿诱导的细胞凋亡具有一定的抑制作用. 但p53、p21Waf1和Bax在血清饥饿诱导后都有诱导性表达, 与HCV核心蛋白是否表达无关. 表明这种情况下的细胞凋亡是p53非依赖性的. 不表达HCV核心蛋白的细胞系, 细胞受到血清饥饿后诱导的细胞凋亡可由p38/MAPK的特异性抑制剂SB203580部分逆转, 但在表达HCV核心蛋白的细胞系中没有阻断作用. 血清饥饿激活的p38 MAPK, 在表达HCV核心蛋白的细胞系中, 其磷酸化形式的蛋白水平有显著下降. 表明HCV核心蛋白对于血清饥饿诱导的细胞凋亡具有抑制作用, 而且这种抑制作用是p38 MAPK激活依赖性的.
MAPK信号转导系统在细胞的增生、恶性转化和应激应答的调节中具有重要作用. HCV核心蛋白具有潜在的致瘤作用, 但机制目前不十分清楚. MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)的激酶(MEK)-ERK信号转导途径以及其下游的靶基因, 即血清应答元件(SRE), 在BALB/3T3表达HCV核心蛋白时被激活. 为了阐明HCV核心蛋白激活MEK-ERK途径的机制, Huang et al[31]以HCV核心蛋白瞬时转染几种不同的细胞系, 并应用Gal4-Elk1萤虫素酶报告基因表达载体、体外MAPK的Western blot杂交分析对其信号转导途径进行了研究. 发现存在有丝分裂原的刺激时, HCV核心蛋白可增强MEK下游的Elk1的激活, 而对ERK活性及Elk1的磷酸化没有影响. 研究结果表明HCV核心蛋白可通过经典的磷酸化修饰链激活Elk1. 说明HCV感染引起肝细胞发生恶性转化的可能的机制之一.
HCV感染与HCC有关, 而HCC的发生与MAPK/ERK信号转导途径有关, 因此Pileri et al[32]研究了HCV核心蛋白对于MAPK/ERK级联反应的影响. HCV核心蛋白可显著激活MAPK/ERK的级联反应, 包括Elk1. HCV核心蛋白单独情况下就可以激活MAPK/ERK. 有趣的是, Elk-1的活性在受到促癌因子12-O-四葵酸佛波乙酯(12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate, TPA)的作用下进一步升高, 但表达HCV核心蛋白的NIH 3T3和HepG2细胞受到表皮生长因子(EGF)和肿瘤坏死因子α(TGFα)的刺激后, 没有进一步的升高. HCV核心蛋白对MAPK/ERK的激活作用, 当受到MEK1特异性抑制剂PD98059时则被阻断. 这些研究结果表明, HCV核心蛋白激活ERK是肝细胞有丝分裂原介导的信号非依赖性的, 但与TPA有协同作用. HCV核心蛋白可能存在对MEK1的调节作用, 或者对更为上游的信号转导环节产生影响.
在针对病原体的早期免疫应答过程中有补体成分的参与, 补体成分在清除病原体感染宿主血清中的抗原中具有十分重要的作用. Rice et al[33]研究表明HCV核心蛋白在HCV感染的初期首先表达, 并且在HCV感染宿主的血液循环中存在, 通过与补体受体的结合, 即C1q受体球状位点(gC1qR)的结合, 抑制T细胞的增生反应. 为了研究HCV核心蛋白与C1qR相互作用及其对T细胞增生的抑制作用及机制, 研究了HCV核心蛋白对于T细胞激活早期事件的影响. 发现HCV核心蛋白抑制ERK和丝裂原激活ERK激酶(MEK)蛋白的磷酸化. HCV核心蛋白对于ERK/MEK MAPK的干扰, 造成了白介素-2(IL-2)和白介素-2受体α(IL-2Rα)基因转录水平的下降, 最终造成IL-2的产生以及高亲和力IL-2R的表达水平的下降. 抗-gC1qR抗体可以逆转HCV核心蛋白对ERK/MEK磷酸化水平的影响, 说明HCV核心蛋白和gC1qR与ERK/MEK MAPK的激活有关. 表明HCV核心蛋白可通过补体依赖性的调节途径阻断T细胞激活的细胞内事件, 在HCV慢性感染的形成过程中发挥重要作用.
慢性丙型肝炎发病机制中氧化应激产生的活性氧(ROS)发挥一定的作用. 吞噬细胞及激活的巨噬细胞释放的ROS是主要氧化应激产物的来源. 但是HCV蛋白作用于单个核细胞后产生活性氧的情况目前还不十分清楚. Higginbottom et al[34]对于HCV刺激的单个核细胞产生活性氧的情况进行了研究. 健康正常人的外周血单个核细胞(PBMC)受到HCV的核心蛋白、NS3、NS4、NS5蛋白刺激以后, 以化学发光技术对于产生的ROS进行了测定. 发现只有NS3蛋白可以触发PBMC产生ROS, 主要包括阴性氧离子. PBMC受到NS3刺激以后, 出现快速而短暂的细胞内钙水平的升高. 应用不同的代谢抑制剂, 证实ROS的产生需要钙离子的流入, 以及酪氨酸激酶以及应激激活蛋白激酶p38的参与. 发现p47(PHOX)发生磷酸化和细胞内转位, 表明在这一过程中有NADPH氧化酶的参与. NS3对于佛波豆蔻酸乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导的氧化爆发(oxidative burst)具有抑制作用. 研究结果表明HCV NS3蛋白可激活NADPH氧化酶, 调节ROS的产生, 在HCV感染的发病机制中具有一定作用.
Flint et al [35]建立四环素应答元件严谨控制的HCV全长编码区表达型转染细胞系, 并研究了HCV 蛋白对IFNα介导的信号转导的影响. HCV蛋白的表达, 强烈抑制IFNα介导的JAK-STAT系统的信号转导. 这种抑制作用与STAT酪氨酸磷酸化下游的信号转导途径有关, 而且对于JAK-STAT信号转导途径的抑制作用不仅限于IFNα, 而且可抑制白血病抑制因子(LIF)诱导STAT3的信号转导. 但对于TNFα诱导的转录因子NF-κB的激活没有影响. HCV干扰IFNα介导的JAK-STAT信号转导, 与对IFNα治疗的抗性作用无关, 而可能与HCV感染后免疫逃逸以及慢性感染的形成过程有关.
HCV亚基因组复制子(replicon)在肝细胞中的复制, 可刺激干扰素β(IFN β)启动子, 并使人肝癌细胞系产生IFN β. 研究发现, HCV RNA的复制可激活NF-κB和IFN调节因子(IRF-1)的激活和DNA结合功能. 在细胞核中, 激活形式的IRF-3也增多. 含有HCV复制子的肝癌细胞系, 由IFNβ激活的一系列的抗病毒作用基因的基础表达水平都显著提高. HCV RNA 的复制, 可刺激细胞抗病毒机制, 并使细胞进入抗病毒状态. 稳定的HCV RNA复制要面对一些抗病毒作用机制的应答, 提示HCV可能会编码一种或多种病毒蛋白, 克服细胞产生的这些抗病毒机制, 以形成慢性感染.
Flint et al[36]应用HCV亚基因组复制子细胞模型, 研究了HCV-肝细胞之间相互作用的可能机制. 研究结果证实, HCV RNA亚基因组的复制可刺激双链RNA(dsRNA)的信号转导系统, 阻断IRF-1和PKR的信号转导, 与dsRNA结合以及抑制dsRNA对PKR的激活作用有关. NS5A蛋白单独情况下就足以阻断IRF-1的激活以及dsRNA依赖性IRF-1基因表达的诱导. PKR结合位点及其附近核苷酸序列的突变, 可以解除NS5A的上述抑制作用, 导致IRF-1表达水平升高, HCV RNA复制水平降低. 这些研究结果表明在dsRNA信号转导中具有重要作用的PKR, 以及病毒感染激活的IRF-1的功能异常, 是HCV NS5A阻断宿主抗病毒应答以及形成慢性感染的主要机制. HCV NS5A具有通过氧化应激机制诱导细胞质中转录因子NF-κB和STAT-3的作用. NS5A可导致细胞内钙的异常. Ca2+所介导的信号触发线粒体活性氧成分的提高, 导致转录因子蛋白NF-κB和STAT-3向细胞核内的转位. 研究表明NS5A可以持续激活STAT-3. 在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或Ca2+鳌合剂(EGTA-AM, TMB-8)存在的条件下, NS5A诱导的NF-κB和 STAT-3的激活作用消失. HCV NS5A与对IFNα的抗性有关, 其机制之一就是NS5A对于IFNα诱导关键酶, 即双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的抑制作用, 但IFNα敏感和抵抗的HCV NS5A在Hela细胞中对于ISGF-3的表达的影响没有显著的差别. NS5A蛋白缺失氨基末端110、222和334个氨基酸残基, 以及羧基末端缺失117、 230氨基酸残基时, 对于IFNα诱导ISGF-3的表达也没有显著的影响. HCV NS5A的表达也不影响IFNα诱导的STAT-1 酪氨酸磷酸化以及上调PKR及MHC-I抗原的表达. 但NS5A可以诱导人细胞中IL-8 mRNA和蛋白的表达, 这一效应与体外NS5A抑制IFNα的抗病毒作用有关. NS5A可诱导IL-8启动子指导的报告基因的表达, 这种调节作用与IL-8 启动子序列中133 bp的序列有关. 氨基末端缺失110、222个氨基酸残基的NS5A突变体, 具有比全长NS5A更强的诱导IL-8启动子活性作用, 因为这种突变形式的NS5A蛋白更能分布在细胞核中. IL-8启动子突变研究表明, NF-κB和AP-1转录因子的结合是NS5A对其进行调节的必要环节. 因此, HCV NS5A蛋白对于趋化因子的调节, 也是影响细胞对于IFNα敏感性的重要机制之一.
在HCV感染者外周血单个核细胞(PBMC)受到IFNα的刺激以后, IRF-1 mRNA和IRF-1/IRF-2比率较正常人显著升高. Sendai病毒刺激以后, 正常人和HCV感染者外周血单个核细胞的IRF-1、IRF-2和IFNα mRNAs, 以及IFNα蛋白表达水平也显著高于基础水平. 自然感染HCV诱导PBMC的IFNα5表达水平升高. 这些细胞体外感染Sendai病毒可以提高正常人和HCV感染者的IFNα8 的表达水平. 病毒感染诱导的IFNα表达具有型特异性, 认为HCV感染可以特异性地诱导PBMC中IFNα5的表达[37].
丙型肝炎病毒NS5A蛋白对于PKR具有抑制作用. PKR所介导的IFNα抗病毒作用部分地通过抑制eIF2α的磷酸化, 进而抑制mRNA翻译而实现. Lahm et al[38]研究了HCV NS5A蛋白对PKR影响mRNA翻译过程的抑制作用. 痘苗病毒载体VV E3L表达的蛋白是PKR很强的一种抑制因子. 以IFNα预处理表达缺陷型基因的VVDeltaE3L HeLa S3细胞, PKR和eIF2α的磷酸化水平都显著升高. 当表达NS5A蛋白的VVNS5A细胞系受到IFNα刺激时, PKR和eIF2α的磷酸化水平出现瞬时下降. 表达VVDeltaE3L的细胞系受到IFNα的刺激以后, p38 MAPK活性升高, 符合其位于PKR信号转导的下游的事实. 另外观察到这些细胞中eIF4E的磷酸化水平升高, 这是p38下游的信号转导环节. 在VVNS5A感染的细胞系中这些调节作用都有不同程度的下降. NS5A还具有抑制表达NS5A蛋白受到EGF激活时的p38-eIF4E磷酸化的作用. NS5A诱导的eIF2α和eIF4E磷酸化可能在调节mRNA翻译过程中有矛盾. 事实上表达VVNS5A的细胞系受到IFNα的刺激以后, 只是部分短暂地回复VVDeltaE3L细胞与病毒的mRNA翻译过程. 综上所述, NS5A作为一种PKR的抑制物, 在总体上具有维持HCV感染早期mRNA翻译水平的功能, 而感染晚期更使HCV mRNA适合帽状结构非依赖性的翻译过程.
在细胞内, HCV NS5A蛋白可在细胞丝氨酸/苏氨酸激酶的催化作用下发生磷酸化. 为了确定NS5A蛋白在细胞内磷酸化的位点, Borowski et al[39]以同位素标记HCV-H NS5A的磷酸多肽, 进行纯化, 对于磷酸化氨基酸残基位点进行分析, 并通过Edman降解法证实. 发现HCV-H NS5A蛋白磷酸化的位点是Ser(2321). 这一磷酸化位点的确定, 得到了另外2种方法研究结果的证实. 如对于Ser(2321)突变为Ala, 磷酸化蛋白修饰立即消失, 对于合成多肽片段的磷酸化修饰研究结果进行分析, 证实NS5A蛋白的磷酸化修饰位点为Ser(2321). 对于NS5A的Ser(2321)位点进行定点诱变, 表明NS5A蛋白的磷酸化修饰是NS4A和PKR结合非依赖性的. NS5A蛋白富含脯氨酸的位点恰好位于Ser(2321)的周围, 如PLPPPRS(2321)PPVPPPR, 表明细胞内脯氨酸特异性激酶是HCV NS5A磷酸化的激酶类型, 这与以前以蛋白激酶抑制剂研究的结果是一致的.
NS5A蛋白分子结构中存在几个富含脯氨酸(proline-rich)的序列结构, 与SH3结合位点结构一致, 提示在信号转导的调节过程中具有十分重要的作用. NS5A可以与Grb2接头蛋白(adaptor protein)结合. Kato et al[40]以抗-Grb2抗体的免疫印迹分析结果表明, 从表达HCV NS5A蛋白的HeLa S3细胞来源的免疫复合物, 发现了NS5A与Grb2的结合. Grb2蛋白N-末端SH3结构域的突变显著影响与NS5A蛋白之间的结合, 但C-末端的SH3位点的基因突变则影响不大. Grb2分子中2个位点同时突变则造成Grb2与NS5A蛋白之间的结合完全消失, 说明Grb2蛋白分子中的这2个SH3结构域在与NS5A蛋白的结合过程中具有协同作用. NS5A的突变分析结果表明, 富含脯氨酸的SH3结合区在所有基因型的HCV病毒株都是保守的. NS5A蛋白在细胞内的表达抑制HeLa S3细胞中ERK1/2的磷酸化. 稳定表达NS5A蛋白的HeLa细胞在受到EGF的刺激后ERK1/2不发生磷酸化. 在这些细胞受到EGF的刺激后发生NS5A与Grb2蛋白之间的结合. 因此, NS5A可能是通过与选择性接头蛋白的结合, 干扰Grb2介导的信号转导.
HBV DNA中的CP指导两个相关的RNA分子的转录, 即前-C和核心RNA的转录. 既往的研究表明, 慢性HBV感染者的CP经常发生2个核苷酸的突变, 从而造成核受体结合位点与转录因子(HNF-1)的结合能力下降, 造成转录水平的抑制. 这种基因突变同时也造成与X蛋白编码区的2个密码子的变化. Li et al[41]的研究结果表明, X蛋白及其突变体在体内外可以与HNF-1结合. X蛋白及其突变体都可以提高HNF-1的基因转录水平以及与X蛋白的结合能力. 这一结果首次发现了X蛋白能够促进转录因子蛋白的DNA结合活性. X蛋白及其突变体在刺激HNF-1活性中的作用不同, 仅仅小量的X突变体蛋白就可以产生较大的反式激活作用, 显著提高HNF-1的DNA结合能力. X蛋白与突变体蛋白之间的这种差别, 在HBV感染的致病机制中具有重要意义, 也说明了不同的CP结构具有不同的HNF-1的结合位点的原因.
干扰素刺激应答元件(ISRE)/干扰素调节元件(IRE)位于HBV DNA的1091-1100 nt之间, 恰好位于增强子I(Enh I)/X基因启动子区, 与XP活性调节密切相关, 增强子I/X基因启动子/ISRE/IRE组成了一个功能性的调节集团, 与IFNα和ISGF3的特异性转录激活过程有关.
丙型肝炎病毒基因组结构的5'-NTR具有特殊的二级结构形式, 这是保证HCV进行正确翻译过程的重要的先决条件之一. HCV RNA 5'-NTR的核苷酸长度为341 nt. 研究表明, 几乎所有这些核苷酸都参与了内部核糖体进入位点(IRES)的形成. 其基本的二级结构包括四个茎-环(stem-loop)结构, 即第I-IV茎-环结构[42]. 研究表明, 这四段不同的二级结构形式, 在HCV RNA翻译过程中都具有十分重要的作用[43,44]. 每一个不同的茎-环结构通过与不同的翻译有关的蛋白质因子的结合, 对HCV RNA的翻译过程起重要的调节作用.
丙型肝炎病毒RNA 5'-NTR的翻译起始过程是一种由IRES介导的帽状结构形成非依赖性的过程. Worman et al[45]应用研究RNA-蛋白结合的紫外交联技术, 证实多聚嘧啶核苷酸序列结合蛋白(PTB)能够至少与5'-NTR中的3段不同的结构区段进行结合, 在HCV RNA 5'-NTR的翻译过程中发挥重要的调节作用. 对于PTB蛋白结合的这三段5'-NTR的核苷酸序列进行分析, 证实都有高度保守的多聚嘧啶核苷酸序列. 应用HCV RNA 5'-NTR结构区的序列而设计的竞争性核苷酸序列进行的竞争性结合实验研究结果表明, 这种结合是蛋白质因子类型和核苷酸序列特异性的过程. 应用免疫沉淀技术证实, 从Hela细胞中提取的PTB蛋白的同分异构体形式的这种蛋白, 能够与HCV RNA 5'-NTR结合. 以PTB的单克隆抗体事先将Hela细胞中的PTB蛋白免疫清除的实验结果表明, PTB蛋白与HCV RNA 5'-NTR的结合, 是HCV RNA翻译过程所必须的步骤. 另外还发现, 如果向免疫清除Hela蛋白混合物中再补足PTB蛋白, 也不能有效地恢复由HCV RNA 5'-NTR介导的翻译过程, 说明除了PTB蛋白之外, HCV RNA 5'-NTR介导的翻译过程, 还必须有另外的PTB蛋白质相关因子的参与. 也就是说, 在以PTB蛋白特异性单克隆抗体免疫清除PTB蛋白的同时, 可能也将另外的与HCV RNA翻译有关的PTB结合蛋白一起去除了. 因此, 单纯向这种蛋白复合物中添加PTB蛋白是远远不够的. 要完成HCV RNA的翻译过程, 必须有包括PTB蛋白等多种细胞蛋白质因子的参与.
Casbarra I[46]的研究表明, La自身抗原(La autoantigen)也是一种HCV RNA 5'-NTR结合蛋白, 并对HCV RNA的翻译起始活动具有关键的调节作用. 同样也是应用紫外交联技术对于HCV RNA结合蛋白的种类进行了分析. 结果表明, La自身抗原是HCV RNA 5'-NTR特异性结合的蛋白质分子. 进一步的研究表明, 几乎完整HCV RNA 5'-NTR的341个核苷酸组成的茎-环结构, 都是与La自身抗原进行结合所必须的, 而且这种RNA-蛋白之间的结合, 可以启动HCV RNA的翻译过程. 有趣的是, HCV RNA结构中的翻译起始点(AUG)也是5'-NTR与La自身抗原结合的必备条件. 如果将完整HCV RNA 5'-NTR的核苷酸序列, 只是缺失掉AUG或替换成其他核苷酸, 则不具备与野生型HCV RNA 5'-NTR竞争性结合La自身抗原的能力. 说明La自身抗原与HCV RNA之间的结合过程, 不仅是茎-环二级结构完整性依赖性的, 同时也是翻译起始密码子依赖性的. 因此La自身抗原是调节HCV RNA翻译活动的重要的宿主细胞的蛋白质因子.
Fukuda et al[47]对多聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBP-1)和PCBP-2等HCV RNA 5'-NTR特异性结合蛋白进行了研究. 首先以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白的形式, 以大肠杆菌表达PCBP-1和PCBP-2重组蛋白, 并证实了与HCV RNA进行特异性结合的能力. 制备了PCBP-2的特异性抗血清, 同时证实了这种特异性抗血清能够与HCV RNA 5'-NTR和从Hela细胞质提取的蛋白三者共同形成超级复合物. 对于这种结合的HCV RNA 5'-NTR的结构依赖性进行研究, 发现几乎所有的内部核糖体进入位点(IRES)的核苷酸序列, 都是与PCBP-2结合所必备的. 说明HCV RNA 5'-NTR与PCBP-2之间的结合, 是IRES序列依赖性的, 而且也是IRES结构完整性依赖性的. 根据PCBP-2在细胞内的分布特点, 认为HCV RNA 5'-NTR与PCBP-2之间的结合发生在HCV感染细胞的细胞质内.
丙型肝炎病毒这些结构比较简单的生物类型, 一般来讲, 都必须借助于感染的宿主细胞内的环境因素, 才能完成其生活周期. HCV RNA 5'-NTR仅有341个核苷酸长度, 但是却指导长达10 kb的开放读码框架(ORF)的翻译过程, 因此, 除了其自身的基因组翻译成的蛋白质分子以外, 还必须借助于感染宿主细胞的一些蛋白质因子. 自然想到的是细胞中一些参与蛋白翻译过程的蛋白质因子. Tsuchihara et al[48]研究了真核细胞翻译起始因子(eIF3)在HCV RNA翻译起始过程中的作用. 研究结果表明, eIF3能够与HCV以及经典猪发热病毒(CSFV)RNA中的IRES结合, 对这两种病毒的翻译起始具有重要的调节作用. 利用化学和酶学足迹法对于eIF3'-IRES复合物进行分析, 结果表明, eIF3的结合可以保护IRES第III茎-环结构中的IIIb位点的茎部顶端单链核苷酸序列区. 应用RNA酶ONE和V1两种酶的足迹实验都得到了相同的研究结果. 以引物延伸实验也证实了茎-环结构IIIb或者其相邻的IIIc发夹状结构的完整性, 都是eIF3与IRES区结合所必备的条件. 以32P-标记的HCV RNA探针进行的紫外交联实验的研究结果表明, HCV RNA的5'-NTR至少与eIF3蛋白复合体中的4种蛋白质成分(P170, P116, P66和P47)进行结合. 这一研究结果表明, 病毒的IRES蛋白翻译过程, 是要通过借助病毒感染细胞翻译起始蛋白质因子的作用才能实现的.
Reed et al[49]以高度保守的HCV RNA 5'-NTR为探针, 应用凝胶电泳迁移率法, 对于HCV RNA 5'-NTR结合的蛋白质成分进行了研究, 以阐明HCV感染的靶细胞中的某些蛋白质成分对于HCV复制和表达过程的调节作用. 结果发现分子量为87 kD和120 kD的两种蛋白质分子能够与HCV RNA的5'-NTR区进行特异性结合. 对于HCV RNA 5'-NTR序列结构特点, 与细胞蛋白结合的序列结构依赖性进行研究, 发现5'-NTR的131-253 nt之间的核苷酸序列, 是这两种蛋白结合的关键序列结构. 如果将5'-NTR中的第III段茎-环结构中的多聚嘧啶区的核苷酸序列191-UCCUUUCUU-199, 换成191-UCCUUUggU-199时, 这种RNA-蛋白复合物则不再形成. 因此, 87 kD和120 kD这两种细胞蛋白是5'-NTR第III茎-环结构结合特异性的蛋白质分子, 但多聚嘧啶核苷酸区发生基因突变时, 仅仅造成87 kD蛋白与5'-NTR结合能力的丧失, 而对于120 kD蛋白与5'-NTR的结合没有显著的影响. 作者根据这些研究结果, 提出87 kD蛋白与HCV RNA的复制过程有关, 而120 kD的蛋白质则与HCV RNA 5'-NTR的翻译过程有关.
肝炎病毒在肝细胞中的复制和表达存在十分复杂的机制, 虽然肝炎病毒, 特别是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒主要是感染肝细胞, 但是对其他细胞类型也具有一定的感染能力. 决定HBV、HCV嗜肝细胞特性的分子生物机制, 主要还是肝细胞中存在特殊的大分子环境, 适合肝炎病毒完成其复制和表达的生活周期, 这种大分子条件是肝细胞中所存在的蛋白质成分, 这些蛋白质成分与肝炎病毒基因组DNA/RNA的结合以及反式调节, 决定了肝炎病毒相对嗜肝细胞的特点. 因此, 关于肝炎病毒反式调节机制的研究, 从理论上可以加深对于肝炎病毒的分子生物学调控机制的深入了解, 为探索抗肝炎病毒的新技术、新疗法奠定坚实的理论基础[50,51].
肝炎病毒存在复杂的反式调节机制, 这一特点也是设计新型治疗技术和方法的重要理论根据. 例如显负性突变体(dominant negative mutant)的设计与抗乙型肝炎病毒复制的研究, 利用反式调节机制提高基因治疗中目的基因的表达水平, 或者作为基因治疗的目的基因何时表达的开关, 都有重要的意义.
显负性突变体的构建, 在抗病毒基因治疗新兴技术的设计中具有重要地位. 乙型肝炎病毒的核心蛋白等其他类型的病毒蛋白在HBV的复制和表达过程具有十分重要的促进和调节作用. 如果构建核心蛋白的突变体, 作为基因治疗的目的基因进行表达, 这种显负性突变体的表达, 可以竞争地结合野生型核心蛋白的结合靶位, 但是却缺乏野生型核心蛋白的反式调节作用. 从一定程度上形成了竞争性结合抑制, 对于乙型肝炎病毒的复制和表达进行有效抑制, 实现抗病毒的基因治疗[52,53].
利用反式调节机制提高目的基因表达水平和作为基因治疗时目的基因表达的开关, 不仅仅限于肝炎病毒的新型治疗技术的设计, 在人免疫缺腺病毒(HIV)的新型治疗技术和方法的设计中得到更为广泛的应用. 已知HIV的长末端重复序列中存在HIV基因编码的反式激活蛋白Tat的应答元件, 在HIV的复制和表达的调节中具有重要作用. 因此, 将干扰素α的编码基因构建到LTR启动子序列的下游, 构建基因治疗的表达载体, 如果没有反式激活剂Tat蛋白的存在时, 目的基因的表达水平只是处于很低的水平, 但是当环境中因为出现HIV的感染而表达反式激活剂Tat蛋白时, 受到反式激活以后, 基因治疗的靶基因, 即干扰素的表达水平显著升高, 与基础表达水平相比较可以提高200倍. 这种反式激活作用机制至少具有两方面的意义, 一是可以满足基因治疗过程中目的基因表达水平普遍偏低的情况, 另外. 这种反式调节机制, 更加适合基因治疗目的基因表达水平调节的目的, 即没有HIV感染时, 基因治疗的目的基因表达水平可以只是很低的基础水平的表达, 不至于基因治疗目的基因持续高水平的表达导致机体功能的紊乱, 但是一旦有感染存在时, 就立即启动目的基因的表达, 进行抗HIV的基因治疗. 随着基因治疗的效果的显现, 病毒复制表达水平又进一步降低, 环境中的反式激活病毒蛋白水平下降, LTR中的启动子活性又开始逐渐下降, 目的基因水平的表达也随之进一步下降, 恢复到对机体影响较小的基础表达水平, 以减少基因治疗目的基因高水平持续表达所带来的可能的毒副作用. 因此, 可以实现抗病毒基因治疗过程中目的基因表达水平的实时调控. 这一点是其他的基因治疗技术和方案所不能比拟的. 因此, 病毒基因表达的反式调节机制在新型抗病毒基因治疗技术的设计中也有重要的应用前景.
Basu et al [54]在研究脊髓灰质炎病毒(PV)IRES介导的PV病毒基因组翻译过程调节的过程中, 发现一小段来源于酵母细胞的RNA片段(60 nt), 对于PV的IRES介导的翻译功能具有显著的抑制作用. 这一小段RNA片段即称为抑制性RNA(IRNA)片段. 联想到HCV RNA的翻译过程也是由IRES结构介导的, 因而推测这种IRNA片段可能对HCV的翻译功能也有抑制作用. Heim et al[55]构建了HCV IRES介导的报道基因表达载体和IRNA的表达载体, 共同转染肝癌细胞系Huh7时, 发现IRNA的表达, 对于HCV RNA IRES介导的翻译活性具有明显的抑制作用. 持续IRNA表达对于Huh7细胞系的生长特点没有显著的影响. 同时注意到, IRNA的表达只是抑制由IRES介导的帽状结构形成非依赖性的翻译过程, 而对于宿主细胞的帽状结构形成依赖性翻译机制没有显著的影响[56,57]. 当以HCV IRES与PV的其他部分重组构建嵌合病毒时, IRNA也能显著抑制这种嵌合病毒的复制和表达. 研究表明, IRNA对于HCV RNA 5'-NTR翻译机制的干扰和抑制作用, 主要是通过对La自身抗原与HCV RNA 5'-NTR结合过程的抑制作用而实现的. 因此, 对HCV RNA 5'-NTR结构及其结合蛋白的研究将为抗HCV新型治疗方法的设计奠定坚实的基础.
| 1. | 成 军, 张 玲霞. 抗HCV的基因治疗方案－根据HCV与肝细胞相互作用的分子生物学机制设计. 国外医学流行病学传染病学分册. 1999;26:59-61. |
| 2. | 刘 妍, 董 菁, 成 军, 钟 彦伟, 夏 小兵, 李 克, 王 琳, 施 双双, 段 惠娟. 乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究. 解放军医学杂志. 2001;26:404-406. |
| 3. | 成 军, 陈 菊梅. 丙型肝炎病毒NS5A蛋白的生物学调节作用. 国外医学微生物学分册. 2001;24:12-14. |
| 8. | Waris G, Siddiqui A. Interaction between STAT-3 and HNF-3 leads to the activation of liver-specific hepatitis B virus enhancer 1 function. J Virol. 2002;76:2721-2729. [PubMed] [DOI] |
| 9. | 董 菁, 成 军, 王 勤环, 王 刚, 施 双双, 刘 妍, 夏 小兵, 斯 崇文. 外周血中乙型肝炎病毒截短型囊膜蛋白基因的克隆化与序列分析. 中华肝脏病杂志. 2001;9:163-165. |
| 11. | 刘 妍, 成 军, 王 刚, 李 克, 段 惠娟, 王 琳, 李 莉, 张 玲霞, 陈 菊梅. HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白协同反式激活功能. 中华肝脏病杂志. 2002;10:354-357. |
| 12. | 刘 妍, 成 军, 张 跃新, 段 惠娟, 牟 劲松, 韩 萍, 李 莉, 张 玲霞, 陈 菊梅. 截短型HBsAg中蛋白反式激活基因的克隆. 中华传染病杂志. 2002;20:218-221. |
| 13. | Ogden SK, Lee KC, Barton MC. Hepatitis B viral transactivator HBx alleviates p53-mediated repression of alpha-fetoprotein gene expression. J Biol Chem. 2000;275:27806-27814. [DOI] |
| 14. | Lee S, Tarn C, Wang WH, Chen S, Hullinger RL, Andrisani OM. Hepatitis B virus X protein differentially regulates cell cycle progression in X-transforming versus nontransforming hepatocyte (AML12) cell lines. J Biol Chem. 2002;277:8730-8740. [PubMed] [DOI] |
| 15. | Lee MO, Kang HJ, Cho H, Shin EC, Park JH, Kim SJ. Hepatitis B virus X protein induced expression of the Nur77 gene. Biochem Biophys Res Commun. 2001;288:1162-1168. [PubMed] [DOI] |
| 16. | Nijhara R, Jana SS, Goswami SK, Rana A, Majumdar SS, Kumar V, Sarkar DP. Sustained activation of mitogen-activated protein kinases and activator protein 1 by the hepatitis B virus X protein in mouse hepatocytes in vivo. J Virol. 2001;75:10348-10358. [PubMed] [DOI] |
| 17. | Tarn C, Lee S, Hu Y, Ashendel C, Andrisani OM. Hepatitis B virus X protein differentially activates RAS-RAF-MAPK and JNK pathways in X-transforming versus non-transforming AML12 hepatocytes. J Biol Chem. 2001;276:34671-34680. [PubMed] [DOI] |
| 18. | Kang-Park S, Lee JH, Shin JH, Lee YI. Activation of the IGF-II gene by HBV-X protein requires PKC and p44/p42 map kinase signalings. Biochem Biophys Res Commun. 2001;283:303-307. [PubMed] [DOI] |
| 19. | Pflum MK, Schneider TL, Hall D, Schepartz A. Hepatitis B virus X protein activates transcription by bypassing CREB phosphorylation, not by stabilizing bZIP-DNA complexes. Biochemistry. 2001;40:693-703. [DOI] |
| 20. | Park US, Park SK, Lee YI, Park JG, Lee YI. Hepatitis B virus-X protein upregulates the expression of p21waf1/cip1 and prolongs G1→S transition via a p53-independent pathway in human hepatoma cells. Oncogene. 2000;19:3384-3394. [PubMed] [DOI] |
| 21. | Guo SP, Wang WL, Zhai YQ, Zhao YL. Expression of nuclear factor-kappa B in hepatocellular carcinoma and its relation with the X protein of hepatitis B virus. World J Gastroenterol. 2001;7:340-344. [DOI] |
| 22. | Madden CR, Slagle BL. Stimulation of cellular proliferation by hepatitis B virus X protein. Dis Markers. 2001;17:153-157. [PubMed] [DOI] |
| 23. | Shamay M, Barak O, Doitsh G, Ben-Dor I, Shaul Y. Hepatitis B virus pX interacts with HBXAP, a PHD finger protein to coactivate transcription. J Biol Chem. 2002;277:9982-9988. [PubMed] [DOI] |
| 24. | Bouchard M, Giannakopoulos S, Wang EH, Tanese N, Schneider RJ. Hepatitis B virus HBx protein activation of cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 complexes and G1 transit via a Src kinase pathway. J Virol. 2001;75:4247-2457. [PubMed] [DOI] |
| 26. | Li J, Ou JH. Differential regulation of hepatitis B virus gene expression by the Sp1 transcription factor. J Virol. 2001;75:8400-8406. [DOI] |
| 27. | Kim H, Lee YH, Won J, Yun Y. Through induction of juxtaposition and tyrosine kinase activity of Jak1, X-gene product of hepatitis B virus stimulates Ras and the transcriptional activation through AP-1, NF-kappaB, and SRE enhancers. Biochem Biophys Res Commun. 2001;286:886-894. [PubMed] [DOI] |
| 28. | Lee JH, Rho HM. Nuclear factor of activated T cells (NFAT1-C) represses the enhancer II and pregenomic promoter (EnII/Cp) of hepatitis B virus (HBV) through its responsive site GGAGA and nullifies the HBx-driven transcriptional activation. IUBMB Life. 2001;51:255-261. [PubMed] [DOI] |
| 29. | Ahn JY, Chung EY, Kwun HJ, Jang KL. Transcriptional repression of p21(waf1) promoter by hepatitis B virus X protein via a p53-independent pathway. Gene. 2001;275:163-168. [DOI] |
| 30. | Tsuei DJ, Chang MH, Chen PJ, Hsu TY, Ni YH. Characterization of integration patterns and flanking cellular sequences of hepatitis B virus in childhood hepatocellular carcinomas. J Med Virol. 2002;68:513-521. [PubMed] [DOI] |
| 31. | Huang JM, Huang TH, Qiu HY, Fang XW, Zhuang TG, Qiu JW. Studies on the integration of hepatitis B virus DNA sequence in human sperm chromosomes. Asian J Androl. 2002;4:209-212. [PubMed] |
| 32. | Pileri P, Uematsu Y, Campagnoli S, Galli G, Falugi F, Petracca R, Weiner AJ, Houghton M, Rosa D, Grandi G. Binding of hepatitis C virus to CD81. Science. 1998;282:938-941. [DOI] |
| 33. | Rice CM. Is CD81 the key to hepatitis C virus entry? Hepatology. 1999;29:990-992. [PubMed] [DOI] |
| 34. | Higginbottom A, Quinn ER, Kuo CC, Flint M, Wilson LH, Bianchi E, Nicosia A, Monk PN, Mc Keating JA, Levy S. Identification of amino acid residues in CD81 critical for interaction with hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. J Virol. 2000;74:3642-3649. [DOI] |
| 35. | Flint M, Dubuisson J, Maidens C, Harrop R, Guile GR, Borrow P, McKeating JA. Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis C virus E2 glycoprotein. J Virol. 2000;74:702-709. [DOI] |
| 36. | Flint M, Maidens C, Loomis-Price LD, Shotton C, Dubuisson J, Monk P, Higginbottom A, Levy S, McKeating JA. Characterization of hepatitis C virus E2 glycoprotein interaction with a putative cellular receptor, CD81. J Virol. 1999;73:6235-6244. [PubMed] |
| 38. | Lahm A, Yagnik A, Tramontano A, Koch U. Hepatitis C virus proteins as targets for drug development: the role of bioinformatics and modelling. Curr Drug Targets. 2002;3:281-296. [DOI] |
| 39. | Borowski P, Heiland M, Feucht H, Laufs R. Characterisation of non-structural protein 3 of hepatitis C virus as modulator of protein phosphorylation mediated by PKA and PKC: evidences for action on the level of substrate and enzyme. Arch Virol. 1999;144:687-701. [DOI] |
| 40. | Kato N, Yoshida H, Kioko Ono-Nita S, Kato J, Goto T, Otsuka M, Lan K, Matsushima K, Shiratori Y, Omata M. Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses: C-viral core is the most potent signal inducer. Hepatology. 2000;32:405-412. [PubMed] [DOI] |
| 41. | Li J, Xu Z, Zheng Y, Johnson DL, Ou JH. Regulation of hepatocyte nuclear factor 1 activity by wild-type and mutant hepatitis B virus X proteins. J Virol. 2002;76:5875-5881. [DOI] |
| 44. | Alcantara FF, Tang H, McLachlan A. Functional characterization of the interferon regulatory element in the enhancer 1 region of the hepatitis B virus genome. Nucleic Acids Res. 2002;30:2068-2075. [DOI] |
| 45. | Worman HJ, Lin F. Molecular biology of liver disorders: the hepatitis C virus and molecular targets for drug development. World J Gastroenterol. 2000;6:465-469. [PubMed] |
| 46. | Casbarra A, Piaz FD, Ingallinella P, Orru S, Pucci P, Pessi A, Bianchi E. The effect of prime-site occupancy on the hepatitis C virus NS3 protease structure. Protein Sci. 2002;11:2102-2112. [PubMed] [DOI] |
| 47. | Fukuda K, Tsuchihara K, Hijikata M, Nishiguchi S, Kuroki T, Shimotohno K. Hepatitis C virus core protein enhances the activation of the transcription factor, Elk1, in response to mitogenic stimuli. Hepatology. 2001;33:159-165. [PubMed] [DOI] |
| 48. | Tsuchihara K, Hijikata M, Fukuda K, Kuroki T, Yamamoto N, Shimotohno K. Hepatitis C virus core protein regulates cell growth and signal transduction pathway transmitting growth stimuli. Virology. 1999;258:100-106. [PubMed] [DOI] |
| 49. | Reed KE, Rice CM. Identification of the major phosphorylation site of the hepatitis C virus H strain NS5A protein as serine 2321. J Biol Chem. 1999;274:28011-28018. [PubMed] [DOI] |
| 54. | Basu A, Meyer K, Ray RB, Ray R. Hepatitis C virus core protein modulates the interferon-induced transacting factors of Jak/Stat signaling pathway but does not affect the activation of downstream IRF-1 or 561 gene. Virology. 2001;288:379-390. [PubMed] [DOI] |
| 55. | Heim MH, Moradpour D, Blum HE. Expression of hepatitis C virus proteins inhibits signal transduction through the Jak-STAT pathway. J Virol. 1999;73:8469-8475. |