病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-06-15; 11(6): 705-707
在线出版日期: 2003-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i6.705
蛋白激酶C对肾小球前小动脉平滑肌细胞I型IP3受体表达影响
王静艳, 刘沛, 韩峰
王静艳, 刘沛, 韩峰, 中国医科大学附属第二医院感染科 辽宁省沈阳市110004
王静艳, 女, 1963-11-20生, 辽宁省开原县人, 汉族. 1986年中国医科大学本科毕业, 1992年中国医科大学硕士研究生毕业, 副教授. 主要从事慢性肝病及并发症的发生机制和治疗研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助, No. 39870337.
通讯作者: 刘沛, 110004, 辽宁省沈阳市和平区三好街36号, 中国医科大学附属第二医院感染科. syliupei@yahoo.com
电话: 024-83956962 传真: 024-23891793
收稿日期: 2002-09-13
修回日期: 2002-09-20
接受日期: 2002-10-03
在线出版日期: 2003-06-15

目的

探讨蛋白激酶C(PKC)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起的肾小球前小动脉平滑肌细胞(RASMC)内I型三磷酸肌醇(IP3)受体mRNA过度表达的影响.

方法

通过对RASMC的分离、培养, 应用核酸杂交技术分别检测在TNF-α和PKC抑制剂、TNF-α和PKA抑制剂及PKC激动剂作用下, RASMC内I型IP3受体mRNA的表达情况.

结果

TNF-α促进RASMC内I型IP3受体mRNA表达增加; PKC 抑制剂明显抑制TNF-α诱导的I型IP3受体mRNA过度表达的作用(14 814.0±2 029.9, 11 334.0±1 104.9, P<0.05); PKC激动剂能增强RASMC内I型IP3受体mRNA表达(22 554.5±2 625.2, 28 128.0±3 698.6, P<0.05); PKA抑制剂-H89不影响TNF-α诱导I型IP3受体mRNA的表达.

结论

TNF-α影响细胞内储备Ca2+释放信息传递系统可能通过激活PKC作用于I型IP3受体基因, 使I型IP3受体mRNA合成增加, 导致I型IP3受体蛋白过度表达, 参与促进RASMC内储备Ca2+大量释放至胞质, 引起肾小球前小动脉平滑肌收缩, 使肾血流量减少, 肾小球滤过率下降, 导致肾功能异常.

关键词: N/A
引文著录: 王静艳, 刘沛, 韩峰. 蛋白激酶C对肾小球前小动脉平滑肌细胞I型IP3受体表达影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(6): 705-707
Effects of protein kinase C on type I inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor expression in smooth muscle cells of rat glomerular afferent arterioles
Jing-Yan Wang, Pei Liu, Feng Han
Jing-Yan Wang, Pei Liu, Feng Han, Department of Infectious Disease, No 2 Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Supported by: the Natural Scientific Foundation of China, No. 39870337.
Correspondence to: Dr. Pei Liu, Department of Infectious Disease, No 2 Affiliated Hospital, China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China.syliupei@yahoo.com
Received: September 13, 2002
Revised: September 20, 2002
Accepted: October 3, 2002
Published online: June 15, 2003

AIM

To investigate the effects of protein kinase C (PKC) on type I inositol 1, 4, 5-triphosphate receptor (IP3 R) expression in rat glomerular afferent arterioles smooth muscle cells (RASMC) treated with TNF-α.

METHODS

RASMC were isolated and cultured from rats, type I IP3 R mRNA in RASMC treated with TNF-α and PKC activator or TNF-α and PKC inhibitor or PKC activator or PKC inhibitor were detected by Northern blot.

RESULTS

TNF-α enhanced the expression of type I IP3 R mRNA in RASMC; PKC inhibitor significantly inhibited the expression of type I IP3 R mRNA induced by TNF-α(14 814.0±2 029.9, 11 334.0±1 104.9, P<0.05). PKC activator significantly enhanced the expression of type I IP3 R mRNA in RASMC treated without TNF-α(22 554.5±2 625.2, 28 128.0±3 698.6, P<0.05). PKA inhibitor could not inhibit the expression of type I IP3 R mRNA induced by TNF-α.

CONCLUSION

TNF-α plays a role in signal transduction in RASMC. TNF-αmay act as the promoter of type I IP3 R mRNA in RASMC or activates PKC that results in the expression of type I IP3 R protein. PKC and IP3 promote releasing of intracellular Ca2+ in RASMC, inducing RASMC constrict. The renal blood flow diminution is involved in the development of renal dysfunction.

Key Words: N/A
0 引言

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在许多疾病发生中起重要作用[1-3], 是引起重型肝炎发生的重要因子[4]. 当重型肝炎患者出现肝肾综合征(HRS)后, 预后极差. 最近研究[5]报告, TNF-α可以诱导肾小球前小动脉平滑肌细胞(RASMC)内I型三磷酸肌醇(IP3)受体过度表达, 这可能是HRS发生的病理生理学基础. 我们观察RASMC在TNF-α、蛋白激酶C(PKC)抑制剂和激动剂的作用下, 细胞内I型IP3受体mRNA表达水平, 探讨TNF-α引起I型IP3受体mRNA过度表达机制.

1 材料和方法
1.1 材料

Wistar, ♂大鼠, 8周龄, 体质量150 g, 由中国医科大学动物中心提供. TNF-α、细胞培养液RPMI1 640、胎牛血清及谷氨酰胺等购于Sigma公司. α-肌动蛋白和肌浆蛋白重链SM-1和SM-2单克隆抗体购于Dako公司. 蛋白激酶C抑制剂(bisindolylmaleimide, GFX)、蛋白激酶C激动剂(phorbol myristate acetate, PMA)和蛋白激酶K抑制剂(dihydrochloride, H89)购于Calbiochem公司.

1.2 方法

肾小球前小动脉平滑肌细胞(RASMC)的分离、培养和鉴定参照Zhu et al (Am J Physiol 1996; 271: f1237)的方法, 应用第3-4代RASMC进行实验. 每次实验用从一只大鼠分离的RASMC进行, 共重复3次实验. 培养细胞长至一单层细胞时进行实验. 每次实验分别设TNF-α(100 μg/L)同时添加GFX(10 nmol/L)和H89(2 μmol/L)2组, 以添加TNF-α为对照组. 另外, 设添加PMA(100 μg/L)组和未添加组. 均在培养8 h收集RASMC, 用硫氰酸瓜裂解经TNF-α和PKC抑制剂、激动剂和PAK抑制剂处理的RASMC, 用酚-氯仿抽提细胞内总RNA, -80 °C保存待用. 根据Nakagawa et al (Proc Natl Sci USA 1991; 88: 6244)报告的I型IP3受体cDNA全序列设计. 引物选自I型IP3受体基因SII(splice domain of the type I IP3R)区段的上下游序列(5'-CGTGGATGTTCTACACAGACCAG-3')和(5'-TTGGAACTTCTTGAAGAGACTA-3'), 由中国科学院上海生物研究所合成. 按照Sharma et al(J Biol Chem 1997;272:14617)报告的方法制备I型IP3受体cDNA探针. 将-80 °C保存的RNA室温溶解后取20 μg加入琼脂糖凝胶后电泳, 转膜, 用32P标记的I型IP3受体cDNA探针进行杂交、洗膜, 自显影. 获得I型IP3受体mRNA特异性电泳带. 然后洗膜去掉核素, 用RNA的18S cDNA作为探针进行2次杂交, 获得18S特异电泳带作为内参. 应用Scion Image图像分析软件对扫描获得的核酸杂交图像进行量化, 然后用质控内参排除操作误差, 进行样本标准化处理. 计算方法如下: 标准化的样本数值=样本量化数值－同一样本内参的量化数值.

统计学处理 将各次应用Scion Image图像分析软件扫描所得各组标准化的样本数值用mean±SD表示. 各组间数据用方差分析进行比较, 当P<0.05时为有显著性.

2 结果

当RASMC 暴露TNF-α(100 μg/L)8 h, RASMC内I型IP3受体蛋白为TNF-α非添加组的1.68倍, I型IP3受体mRNA为0暴露时间组的1.38倍[5]. 为探讨TNF-α诱导RASMC内I型IP3受体过度表达的机制, 我们应用PKC 抑制剂(GFX)、PKC激动剂(PMA)和蛋白激酶K抑制剂(H89)观察在TNF-α作用下, GFX、PMA和H89对RASMC内I型IP3受体mRNA表达的影响.

2.1 PKC 抑制剂的影响

当将GFX(10 nmol/L)和TNF-α同时加入RASMC进行培养, 8 h后检测I型IP3受体mRNA, 经Scion Image图像分析软件对图片扫描, GFX添加组IP3受体mRNA水平为11 334.0±1 104.9, 明显低于非添加组14 814.0±2 029.9, 为对照组的76.5%(对照组为100%), 两组之间比较有显著差异(P<0.05), 说明GFX具有抑制TNF-α诱导RASMC内I型IP3受体mRNA过度表达的作用.

2.2 PKC激动剂的影响

当将PMA(100 μg/L)加入RASMC进行培养, 8 h后检测I型IP3受体mRNA水平, PMA添加组I型IP3受体mRNA表达增加(28 128.0±3 698.6), 与对照组(22554.5±2625.2)(100%)相比较为124.7%; 两组之间比较有显著差异(P<0.05), 说明PMA能增强RASMC内I型IP3受体mRNA表达水平.

当将H89(2 μmol/L)和TNF-α同时加入RASMC进行培养, 8 h后检测I型IP3受体mRNA, 未发现H89对TNF-α增强RASMC内I型IP3受体mRNA表达的影响.

3 讨论

肝硬化、肝癌和重型肝炎常并发HRS[6]. 肾血流减少, 肾小球滤过率降低, 是引起急性肾功能衰竭的主要原因, 而肾小球前小动脉的收缩和舒张功能的状态直接影响着肾血流和肾小球滤过率. 肾小球前小动脉的收缩和舒张受着细胞内Ca2+的调节. 当细胞膜上的受体接受某些特异性物质刺激后, 细胞内出现IP3水平增高, 而增高的IP3与IP3受体结合后导致细胞内储备Ca2+释放, 使效应细胞发生生物反应[7]. 众所周知, 一些血管活性物质, 如内皮素[8]、血管紧张素II、血管加压素[9]和白三烯[10]等均能提高细胞内Ca2+释放, 引起细胞收缩, 其主要机制是刺激细胞内IP3水平增高. 许多临床研究证明[11,12] : HRS患者血清中许多血管活性物质明显增高, 并认为是导致HRS时肾血流量减少和肾小球滤过率下降的主要原因[13]. 但是, 临床上应用血管活性物质拮抗剂治疗HRS未得到良好效果, 提示导致HRS时肾血流量减少和肾小球滤过率下降发生可能还通过其他途径.最近研究发现, 细胞因子可以诱导许多细胞内的第二信使及其受体过度表达. TGF-β可以抑制肾系膜细胞内I 型IP3受体表达, 并抑制血管紧张素II刺激细胞内储备Ca2+释放; 重型肝炎患者血清中TNF-α明显升高[4], 是肝坏死发生的重要因子. TNF-α可以通过活化Fas引起心肌细胞内IP3水平增高, 诱导其细胞凋亡[14]. IP3受体家族在鼠的肾脏上广泛存在, I型和III型IP3受体主要存在于血管壁细胞内, 尤其是血管平滑肌细胞[15]. TNF-α可以诱导RASMC内I型IP3受体蛋白表达增加. 过度表达的I型IP3受体为RASMC内储备Ca2+大量释放提供了可能性[5]. 但是, 细胞内储备Ca2+大量释放又受其他细胞内第二信使(如DAG-PKC)的影响. PKC抑制剂可以使血管肌原性张力降低, 而PKC激动剂则使血管张力增高[16]. 这可能是由于PKC引起IP3受体磷酸化, 动员细胞内储备Ca2+大量释放所致[17]. 活化的PKC可以介导TNF-α对肠上皮细胞的损伤作用[18]. 我们的研究发现, PKC抑制剂－GFX可以明显抑制TNF-α诱导的RASMC内I型IP3受体的过度表达; 而PKA抑制剂－H89无此作用; PKC 激动剂－PMA能增强RASMC内I型IP3受体mRNA表达水平. 在许多生理反应过程中, 需要IP3－Ca2+和DAG－PKC两条信号途径同时参与并协调作用, 尤其是一些细胞对激动剂产生持久反应时, PKC与IP3的协同作用更为突出. 我们的结果提示: TNF-α诱导的RASMC内I型IP3受体的过度表达可能是通过所活化的PKC作用于I型IP3受体的基因促使I型IP3受体mRNA过度表达. 肾血流量受肾小球前小动脉收缩和舒张的控制, 而血管平滑肌细胞内Ca2+水平高低与肾小球前小动脉的舒张收缩功能直接相关. 所以, RASMC内I型IP3受体表达增加和PKC的正反馈作用可能是血管活性物质引起细胞内储备Ca2+释放入胞质, 促进肾小球前小动脉发生异常收缩的病理生理基础.

由此可见, TNF-α在重型肝炎并发肾功能衰竭中起到一定作用, 其作用机制是参与了细胞内的信息传递系统的变化. TNF-α可能是通过直接增强I型IP3受体的mRNA表达或通过所活化的PKC作用于I型IP3受体的基因促使I型IP3受体过度表达, 由此导致I型IP3受体蛋白表达增加. 为重型肝炎、肝硬化患者血中高浓度的内皮素和血管紧张素II刺激RASMC内IP3水平增高, 引起大量储存Ca2+迅速释放入胞质, 致肾小球前小动脉发生异常收缩, 肾血流量减少, 肾小球滤过率降低, 肾功能衰竭发生提供了病理生理学基础.

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