基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-11-15; 11(11): 1699-1702
在线出版日期: 2003-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i11.1699
大黄素对大鼠结肠环行平滑肌细胞[Ca2+]i的影响
马涛, 齐清会, 简序, 费乃昕
马涛, 齐清会, 简序, 费乃昕, 天津医科大学总医院 天津市 300052
马涛, 男, 1972-02-19生, 湖北省公安县人, 汉族, 1994年天津医科大学本科毕业, 2002年天津医科大学博士毕业, 助理研究员, 从事胃肠动力学研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助, No. 30171198.
通讯作者: 齐清会, 300052, 天津市和平区鞍山道154号, 天津医科大学总医院中西医结合外科. qiqinghui@tpt.tj.cn
电话: 022-60362584
收稿日期: 2003-01-12
修回日期: 2003-06-20
接受日期: 2003-07-15
在线出版日期: 2003-11-15

目的

观测大黄素对Wistar大鼠结肠环行平滑肌细胞胞质游离钙水平([Ca2+]i)的影响, 并探讨机制.

方法

酶解法分离结肠环行平滑肌细胞, 分别采用图像分析系统和激光扫描共聚焦显微镜观测细胞长度和[Ca2+]i的变化.

结果

大黄素可收缩大鼠结肠环行平滑肌细胞, 也可浓度依赖性升高[Ca2+]i; 大黄素作用后, [Ca2+]i迅速升高达到峰值([Ca2+]iPeak), 而后下降至平台期([Ca2+]iSustain, 仍高于静息值). Nifedipine对大黄素的钙动员作用没有明显影响, EGTA明显降低[Ca2+]iSustain. Heparine 几乎完全抑制[Ca2+]iPeak, Ryanodine 明显抑制[Ca2+]iPeak.

结论

大黄素通过升高[Ca2+]i收缩结肠环行平滑肌细胞. 大黄素升高[Ca2+]i的机制为: 活化IP3受体释放细胞内钙, 进一步以CICR方式促进RYR受体开放, 共同作用升高[Ca2+]i, 细胞外钙内流参与平台期[Ca2+]i的升高.

关键词: N/A
引文著录: 马涛, 齐清会, 简序, 费乃昕. 大黄素对大鼠结肠环行平滑肌细胞[Ca2+]i的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(11): 1699-1702
Effects of emodin on intracellular Ca2+ signaling in the circular smooth muscle cells of rat colon
Tao Ma, Qing-Hui Qi, Xu Jian, Nai-Xin Fei
Tao Ma, Qing-Hui Qi, Xu Jian, Nai-Xin Fei, Department of Surgery, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30171198.
Corresponding author: Dr. Qing-Hui Qi, Department of Surgery, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China. qiqinghui@tpt.tj.cn
Received: January 12, 2003
Revised: June 20, 2003
Accepted: July 15, 2003
Published online: November 15, 2003

AIM

To investigate whether emodin has any effects on circular smooth muscle cells of rat colon and to examine the underlying mechanisms.

METHODS

Smooth muscle cells were isolated from the circular muscle layers of Wistar rat colon and cell length was measured by computerized image micrometry. Intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) signaling was studied in smooth muscle cells using Ca2+ indicator Fluo-3 AM by laser-scanning confocal microscopy.

RESULTS

Emodin dose-dependently induced smooth muscle cells contraction, caused a large, transient increase in [Ca2+]i followed by a Sustained elevation in [Ca2+]i. Emodin-induced increase in [Ca2+]i was unaffected by nifedipine, a votage-gated Ca2+-channel antagonist, and the Sustained phase of rising of [Ca2+]i was attenuated by extracellular Ca2+ removal with EGTA solution. Inhibiting Ca2+ release from ryanodine-sensitive intracellular stores by ryanodine reduced the Peak increase in [Ca2+]i. However, the application of heparine, an antagonist of IP3R, nearly abolished the Peak increase in [Ca2+]i induced by emodin.

CONCLUSION

Emodin has direct excitatory effect on circular smooth muscle cells from rat colon and its effect is mediated through Ca2+-dependent pathways. Furthermore, emodin-induced Peak [Ca2+]i increase may be attributable to the Ca2+ release from IP3 sensitive stores, which promotes Ca2+ release from ryanodine-sensitive stores through CICR mechanism. Additionally, Ca2+ influx from extracellular medium contributes to the Sustained increase in [Ca2+]i.

Key Words: N/A
0 引言

大黄素属于蒽醌类化合物, 广泛存在于大黄、番泻叶等中药的根、皮等部位[1-3]. 靳珠华et al [4]证实大黄素可促进离体肠道平滑肌条收缩, 杨文修et al [5,6]发现大黄素可升高豚鼠结肠带平滑肌细胞[Ca2+]i. 但大黄素对胃肠道平滑肌细胞是否有直接收缩作用及其发挥作用的机制尚有待于研究. 因此, 我们观测大黄素对大鼠结肠环行平滑肌细胞长度及[Ca2+]i的影响, 探讨大黄素的作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

大黄素(emodin)、HEPES、DMEM、II型胶原酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、saponin、heparine、ryanodine、nifedipine等购自Sigma, Fluo-3 AM 购自Molecular probes, 余试剂均为国产分析纯购自天津市翰洋生物公司. 称取适量大黄素, 先用0.01 mol/L NaOH溶解, 然后用DMEM培养基稀释至1 μmol/L, 调整pH值为7.4, 无菌过滤分装, 4 °C冰箱保存, 使用前稀释至相应浓度.

1.2 方法

(1)结肠环行平滑肌细胞分离: 取Wistar大鼠远端结肠约5 cm, 刮去黏膜, 解剖显微镜下剥离环行肌, 将肌组织剪成约1-2 mm3, 置于10 mL 含1 g/L II型胶原酶、0.1 g/L大豆胰蛋白酶抑制剂的消化液中37 °C连续孵育1 h, 30 min时更换消化液1次, 50目筛网过筛, 收集部分消化的组织用不含酶的HEPES缓冲液冲洗, 然后振荡20 min, 30次/min, 收集自由脱落的细胞供实验用. 台盼蓝染色确定细胞活力达90 %以上符合实验要求. 将细胞浓度调整为5×108/L. (2)平滑肌细胞收缩的测定: 取0.25 ml细胞悬液, 加入相应浓度的实验试剂. 1 min后加入25 g/L戊二醛终止反应. 应用Cmais2000图像分析系统随机测定50个细胞的长度. 收缩反应的计算公式为: 收缩变化百分数＝(用药组平均长度－对照组平均长度)／对照组平均长度×100％. (3)平滑肌细胞[Ca2+]i测定: 将平滑肌细胞接种于预包被L-多聚赖氨酸的盖玻片, 离心促进细胞贴壁, 37 °C温箱孵育60 min后, 加入终浓度7.5 μmol/L Fluo-3 AM和0.2 g/L F-127的HEPES缓冲液. 37 °C孵育30 min, HEPES缓冲液冲洗3次, 37 °C继续孵育20 min. 装入Chamber Slide上机检测. 间隔10 s收集荧光强度图像, 观测200 s, 于60 s末加入大黄素. [Ca2+]i变化以荧光强度相对值表示. 其中峰值 [Ca2+]i([Ca2+]iPeak)由包括峰值在内3时间点的测定值确定, 平台期[Ca2+]i([Ca2+]iSustain)由平台期3个时间点的测定值确定.

统计学处理 数据均以mean±SD表示, 采用Student t test方法进行统计处理. P<0.05提示差别存在显著性.

2 结果
2.1大黄素对结肠环行平滑肌细胞长度和[Ca2+]i的影响

倒置显微镜下, 分离的结肠环行平滑肌细胞呈梭形, 长度各异, 有的处于舒张状态, 有的则处于不同的收缩状态下. 细胞的长度54-129 μm, 平均81.3 μm (图1). 使用5, 10, 25, 50, 100 μmol/L大黄素作用后, 分别测定50个平滑肌细胞长度, 并计算收缩百分数, 结果表明大黄素可收缩平滑肌细胞, 并表现为浓度依赖关系, 50 μmol/L浓度时收缩反应达峰值(17.3±3.5 %) (图2). 静息状态下, 平滑肌细胞胞质的平均荧光强度值(FI)为54.2±6.2. 5, 10, 25, 50, 100 μmol/L大黄素均可升高胞质[Ca2+]i, 峰值平均荧光强度值分别为62.5±5.6, 79.3±6.3, 89.6±5.5, 142.3±8.6, 133.5±4.8 (图3). 动态观测50 μmol/L大黄素对[Ca2+]i的影响, 可发现大黄素作用后[Ca2+]i短时间内迅速升高达到峰值, 后下降至平台期(图4).

图1
图1 游离平滑肌细胞呈梭形, 长度不一.
图2
图2 大黄素收缩大鼠结肠环形平滑肌细胞的量效曲线.
图3
图3 大黄素影响大鼠结肠环形平滑肌细胞[Ca2+]i的量效曲线.
图4
图4 大黄素影响大鼠结肠环形平滑肌细胞[Ca2+]i的动态图.
2.2 Nifidipine和EGTA对大黄素钙动员的影响

Nifidipine (L型钙通道抑制剂, 1 μmol/L)作用10 min后, 加入50 μmol/L大黄素, 观测[Ca2+]i的动态变化. 结果表明Nifedipine对大黄素引起的[Ca2+]iPeak和[Ca2+]iSustain均无明显影响. EGTA(钙螯合剂, 2 mmol/L)对大黄素作用的[Ca2+]iPeak也没有明显影响, 但降低了[Ca2+]iSustain 71.2±6.5)(P<0.05, 图5).

图5
图5 Nifidipine和EGTA对大黄素钙作用的影响 (aP<0. 05).
2.3. Heparin和ryanodine对大黄素钙动员的影响

因为heparin无法穿透细胞膜, 因此在加用heparin前, 用saponin处理细胞, 使heparin可进入细胞内. Heparin (IP3受体拮抗剂, 10 mg/L)和ryanodine (RYR受体拮抗剂, 0.1 μmol/L)与平滑肌细胞孵育30 min后, 加入50 μmol/L大黄素, 观测[Ca2+]i的动态变化. 结果表明heparine作用后[Ca2+]iPeak(81.3±6.5)明显降低, 下降达42.9％ (P<0.05), ryanodine作用后[Ca2+]iPeak (107.5±7.7)也明显降低, 下降达24.4％ (P<0.05, 图6).

图6
图6 Heparin和ryanodine对大黄素作用[Ca2+]iPeak的影响. aP<0.05 vs 大黄素组相比; bP<0.01 vs Ryanodine组相比.
3 讨论

研究证实, 大黄素具有促进胃肠运动的作用[3-6]. 我们首次从细胞水平证实大黄素可直接作用于结肠环行平滑肌细胞, 引起收缩. 表明大黄素的促动力作用可通过肌原性作用实现. [Ca2+]i是决定平滑肌细胞收缩或舒张的关键性因素, [Ca2+]i升高后与CaM结合, 活化Ca2+/CaM依赖性MLCK收缩平滑肌细胞[7-11]. 靳珠华et al [4]通过肌条收缩试验证实大黄素的促动力作用与钙离子有关. 杨文修et al [3,5,6]发现大黄素可升高豚鼠结肠带平滑肌细胞[Ca2+]i. 我们的实验也证实大黄素可剂量依赖性升高大鼠结肠环行平滑肌细胞的[Ca2+]i. 进一步观测50 μmol/L的大黄素对[Ca2+]i的动态影响, 发现大黄素作用后, [Ca2+]i迅速升高达到峰值, 并持续维持于较高的水平(图4).

[Ca2+]i的调节是一个复杂的调节体系, [Ca2+]i的升高可源于细胞外钙内流和/或细胞内钙释放[7-11]. 细胞外钙通过细胞膜上的钙通道进入细胞内, 其中L-钙通道是细胞外钙内流的主要通道[12-15]. Nifedipine是细胞膜L-钙通道的特异性抑制剂, 可抑制经由L-钙通道的细胞外钙内流. 在我们的实验中, 使用nifedipine抑制L-钙通道的活性对大黄素的钙动员作用没有影响, 表明L-钙通道不参与大黄素的钙动员作用; EGTA是一种钙螯合剂, 可结合游离的钙离子. 使用EGTA螯合细胞外钙后, 使[Ca2+]iSustain明显降低, 表明在[Ca2+]i升高的平台期有细胞外钙内流, 但钙内流的通道还有待于进一步研究.

肌质网是平滑肌细胞的细胞内钙贮存库, 已证实肌质网上存在着两种钙释放通道: IP3受体和RYR受体[16-19]. 研究表明IP3受体开放依赖于IP3产生并与之结合[16-18], 而RYR受体的激动剂尚不清楚, 但已证实RYR受体可通过钙诱导钙释放(CICR)的方式参与[Ca2+]i的调节[19,20-25], 所谓CICR是指细胞外钙内流或IP3受体开放释放钙可激活RYR受体开放进一步释放细胞内钙[26-30]. 我们使用的ryanodine和heparine分别是RYR受体和IP3受体的特异性拮抗剂, 可特异性抑制RYR受体和IP3受体的活性. 我们的结果表明, 使用ryanodine抑制RYR受体活性, IP3受体功能正常时, [Ca2+]iPeak明显降低; 而抑制IP3受体活性, RYR受体功能正常时, [Ca2+]iPeak几乎被完全抑制, 与ryanodine作用时[Ca2+]i相比, [Ca2+]iPeak也明显降低(P<0.05). 表明IP3受体介导的钙释放可能是大黄素钙动员作用的关键, 而RYR受体的激活依赖于IP3受体的开放. 因此我们推测大黄素作用后首先通过IP3受体开放释放细胞内钙, 进一步以CICR方式激活RYR受体, 共同作用升高[Ca2+]i.

总之, 我们的实验证实大黄素通过钙依赖性机制收缩大鼠结肠环行平滑肌细胞. 大黄素升高[Ca2+]i的机制为: 活化IP3受体释放细胞内钙, 进一步以CICR方式促进RYR受体活化, 共同作用升高[Ca2+]i, 在[Ca2+]i升高的平台期有细胞外钙内流, 但钙内流的通道有待于进一步研究.

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