幽门螺杆菌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-10-15; 11(10): 1470-1474
在线出版日期: 2003-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i10.1470
幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆、序列测定及其生物信息学分析
白杨, 黄文, 王继德, 张兆山, 周殿元, 张亚历
白杨, 黄文, 王继德, 周殿元, 张亚历, 中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化病研究所 广东省广州市 510515
白杨, 男, 1973年生, 山西省太原人, 汉族, 2002年毕业于第一军医大学, 医学博士, 主治医师, 讲师. 主要从事消化系统疾病的研究.
张兆山, 军事医学科学院生物工程研究所 北京市 100071
基金项目: "863"计划专题, No. 102-07-03-06; 国家自然科学基金, No. 30170890, 30270078; 军队"十五"医药卫生科研课题, No. OIMA-132.
通讯作者: 张亚历, 100071, 广东省广州市广州大道北路1838号, 中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化病研究所. zhangyl@fimmu.edu.cn
电话: 020-61641531
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-20
接受日期: 2002-11-25
在线出版日期: 2003-10-15

目的

获取幽门螺杆菌黏附素基因babA2, 并将他克隆到质粒pET-22b(+)中进行核苷酸序列分析, 并对其进行生物信息学分析, 为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供基础.

方法

利用PCR技术扩增babA2, 并将其定向插入pET-22b(+)载体, 通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析, 生物信息学软件对其进行生物学特性分析.

结果

DNA序列分析表明, 所克隆的babA2基因序列与GenBank公布的一致. ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质分子量约为78 KD, 并显示出了良好的抗原性和疏水性.

结论

本研究获得了序列正确的babA2基因, 生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性, 为其重组表达及其相关研究奠定了良好的基础.

关键词: N/A
引文著录: 白杨, 黄文, 王继德, 张兆山, 周殿元, 张亚历. 幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆、序列测定及其生物信息学分析. 世界华人消化杂志 2003; 11(10): 1470-1474
Cloning, sequencing and bioinformatics analysis of adhesin gene babA2 of Helicobacter pylori
Yang Bai, Wen Huang, Ji-De Wang, Zhao-Shan Zhang, Dian-Yuan Zhou, Ya-Li Zhang
Yang Bai, Wen Huang, Ji-De Wang, Dian-Yuan Zhou, Ya-Li Zhang, PLA Institute for Digestive Disease, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Zhao-Shan Zhang, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
Supported by: grants from State 863 High Technology ; D Project of China (102-07-03-06), the National Natural Science Foundation of China(30270078, 30270078) and the Public Health and Medical Research Project of the Chinese PLA of 10th Five-Year Plan.
Corresponding author: Dr Ya-Li Zhang, PLA Institute for Digestive Disease, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China. zhangyl@fimmu.edu.cn
Received: October 29, 2002
Revised: November 20, 2002
Accepted: November 25, 2002
Published online: October 15, 2003

AIM

To obtain DNA of human Helicobacter pylori (Hp) adhesin gene babA2 and the amplified fragment was inserted into plasmid pET-22b (+) for nucleotide sequencing analysis and to carry out bioinformatics analysis.

METHODS

The babA2 DNA was amplified by PCR and inserted into the plasmid pET -22b (+) and sequenced. The biological property was analysed by the software ANTHEPROT V4.3c.

RESULTS

DNA sequencing analysis showed that the sequence of babA2 DNA was the same as that published by GenBank. ANTHEPROT V4.3c software predicted its relative molecular mass(Mr) was 78 kD and it possessed good antigencity and hydrophobicity.

CONCLUSION

A confirmed babA2 gene has been obtained and bioinformatics analysis showed that it had good immunogenicity. Our study lays a good foundation for recombination, expression and relevant research on adhesin gene babA2 of Helicobacter pylori.

Key Words: N/A
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因[1-6], 与胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴样组织恶性淋巴瘤的发生亦密切相关[7-20]. 此外, 血清流行病学研究表明Hp感染与循环、呼吸、胃十二指肠外消化系统以及自身免疫疾病的发生也有关[21-24]随着Hp病因地位的上升, 对其致病机制的研究日趋深入, Hp的致病机制包括诸多环节, 但尤以其黏附机制最为关键, 因为Hp必须首先定植于人胃黏膜才能进一步发挥其致病作用, 而黏附又是Hp定植在胃黏膜表面的前提. 文献报道的Hp黏附素较多, 但已经证实的有四种, 即LewisB血型抗原(Leb)结合黏附素(BabA)、AlpA、AlpB和HopZ[25]. 其中BabA是迄今为止惟一明确受体的Hp黏附素, 研究表明babA基因存在两个等位基因: babA1和babA2, 其中babA1缺乏10-bp的重复序列, 其蛋白不具有与Leb结合的功能[26]. 目前国内尚未见有关babA2的研究报道, 我们运用PCR技术克隆人幽门螺杆菌babA2基因, 并构建载体对其进行序列及生物信息学分析, 为进一步表达babA2基因, 研究其黏附作用、免疫原性等打下了基础.

1 材料和方法
1.1 材料

菌株BL21(DE3)及质粒pET-22b(+)由军事医学科学院生物工程研究所提供. 幽门螺杆菌SS1为本所保存. 限制性内切酶Not I、Noc I及T4 DNA连接酶、Vent DNA聚合酶购自New England Biolabs公司, Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准λDNA/EcoR I +Hind III购自华美生物工程公司, 琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司, 测序质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司, 其他试剂为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 Hp染色体DNA的提取 固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落, 按基因组DNA小量制备法制备[27].

1.2.2 质粒的提取及纯化 质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法[27].

1.2.3 目的基因的PCR扩增 根据文献[26]设计引物, 在其5'端加上合适的限制性酶切位点, 由军事医学科学院生物工程所张京生合成. 序列如下: babA21: 5'-TG GCC ATG GATAAAAAA CAC ATCCTTTCA-3', babA22: 5'-AG TGC GGC CGC ATA AGC GAA CAC ATA G-3'. 热启动法进行PCR, 95 °C变性30 s, 55 °C退火30 s, 72 °C延伸90 s, 35个循环后再延伸10 min. 0.8%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.

1.2.4 DNA片段的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定[27] 质粒和目的基因DNA经Not I和Noc I双酶切, 玻璃奶回收酶切片段, T4连接酶作用下16 °C连接12 h, 转化宿主菌BL21(DE3), 双酶切鉴定筛选出阳性克隆.

1.2.5 序列测定及分析 碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒, 用自动测序仪进行序列分析.

1.2.6 生物信息学分析 ANTHEPROT V4.3c软件分析其生物学特性.

2 结果
2.1 babA2基因的扩增

PCR结果电泳分析发现在2200 bp左右有一条带, 大小与预计相符.

2.2 重组质粒的构建及酶切鉴定

重组质粒的构建如图1, 将PCR产物经Not I和Nco I双酶切后, 定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中, 获得重组质粒命名为pET-22b(+)/BabA2. 经Not I和Nco I双酶切后的重组质粒电泳, 结果与预计相符.

图1
图1 重组质粒pET-22b(+)/BabA2的构建示意图.
2.3 babA2基因片段的序列分析

直接以重组质粒pET-22b(+)/BabA为模板进行测序, 得到了克隆片段的DNA序列, 与Ilver et al [26]报道的一致. babA2基因编码区的核苷酸序列和氨基酸序列见图2.

图2
图2 Hp粘附素BabA2的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列.
2.4 生物信息学分析结果

ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质分子量约为78 kD, Parker法和Welling法分析均显示出了良好的抗原性(图3, 图4).

图3
图3 BabA抗原性的Parker法分析.
图4
图4 BabA抗原性的Welling法分析.
3 讨论

早在1996年, Wadstr et al [28]推测处在休眠或生长缓慢状态的Hp能够与胃黏膜表面和上皮细胞的Lewis血型抗原相互作用以促进其定植. 之后, Ilver et al [26]研究了Lewis血型抗原中Leb调节Hp黏附的作用. 研究显示, 含Leb的可溶性糖蛋白或抗Leb的抗体能抑制Hp黏附于胃上皮细胞. 他们进一步采用再标记技术发现并纯化了能与人胃黏膜表面Leb特异结合的黏附素－BabA, Mr 78 kD, 免疫电镜显示其位于细菌表面. I型和II型Hp菌株结合Leb的研究显示CagA致病岛的存在与BabA黏附有关. 亲和实验研究表明Leb与BabA的亲和系数约为1×1010M-1, 即每个细菌结合Leb的分子数约为500. 另外, 他们检测了95株临床分离的Hp结合于125I标记的血型抗原的能力, 发现90%的Hp呈现血型抗原结合能力, 其中66%能与Leb结合. 近来, Bosch et al [29]调查了应激状态下唾液中硫酸化Lewis (S-Le)水平与Hp黏附的关系. 结果显示, 随着应激状态下唾液中S-Le浓度、分泌量及S-Le/总蛋白比率的增加, 唾液介导的Hp黏附也增加. 这一结果表明BabA及其受体在Hp致病机制、特别是在宿主应激状态下Hp致病机制中起重要作用.

由于CagA致病岛的存在与BabA黏附有关且只有babA2可以表达BabA[30-37], 因此本研究选用了黏附性强并含有CagA致病岛的Hpss1染色体DNA为模板, 成功得到了babA2的基因. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了带有组氨酸尾巴的融合表达载体, 酶切鉴定和测序结果显示获得了特异的Hp的babA2基因, 生物信息学分析预测其蛋白质Mr 78 kD, 并显示出了良好的抗原性, 为重组表达BabA、研究其黏附功能和免疫保护作用奠定了重要的实验基础.

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