异常凝血酶DCP基因克隆表达、纯化及单克隆抗体制备与鉴定

图1 pCold Ⅱ和pCold Ⅱ-DCP的酶切鉴定. M: DNA标准品; 1: pCold Ⅱ质粒; 2: pCold Ⅱ-DCP重组质粒; 3: 经NdeⅠ与Hind Ⅲ双酶切后的pCold Ⅱ质粒; 4: 经NdeⅠ与Hind Ш双酶切后的pCold Ⅱ-DCP重组质粒. DCP: 去羟基凝血素.

图2 SDS-PAGE分析DCP在37 ℃、25 ℃和15 ℃的表达及可溶性分析. A: DCP在37 ℃、25 ℃表达及可溶性分析. M: 蛋白标准品; 1: 诱导前菌液; 2: 37 ℃诱导后菌液; 3: 37 ℃诱导超声后沉淀; 4: 37 ℃诱导超声后上清; 5: 25 ℃诱导后菌液; 6: 25 ℃诱导超声后沉淀; 7: 25 ℃诱导超声后上清; B: DCP在15 ℃表达及可溶性分析. M: 蛋白标准品; 1: 诱导前菌液; 2: 15 ℃诱导后菌液; 3: 15 ℃诱导后菌液; 4: 15 ℃诱导后上清. 箭头为目的蛋白.

图3 SDS-PAGE分析DCP蛋白的纯化及脱盐. A: DCP蛋白的纯化. M: 蛋白标准品; 1: 超声后沉淀; 2: 流穿液; 3: 洗涤液; 4, 5: 洗脱液; B: 纯化后蛋白的脱盐. M: 蛋白标准品; 1: 透析后的DCP蛋白. DCP: 去羟基凝血素.

图4 SDS-PAGE分析腹水中抗DCP的单克隆抗体的纯化. M: 蛋白标准品; 1: 纯化的3B5抗体.

图5 DCP重组蛋白的Western blot鉴定. 1: 纯化的DCP蛋白; 2, 3: pCold Ⅱ-DCP BL21细菌诱导后; 4: pCold Ⅱ-DCP BL21细菌诱导前. DCP: 去羟基凝血素.

图6 DCP mAb效价测定.

图7 免疫组织化学检测DCP在肝癌组织中的表达(×200). A: 正常肝组织; B: 肝癌组织.