基础研究
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世界华人消化杂志. 2013-12-18; 21(35): 3932-3939
Published online 2013-12-18. doi: 10.11569/wcjd.v21.i35.3932
异常凝血酶DCP基因克隆表达、纯化及单克隆抗体制备与鉴定
沈鹏, 司进, 李琦雯, 渠利利, 李璐蓉, 严晓璐, 季国忠
沈鹏, 李璐蓉, 严晓璐, 季国忠, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心 南京医科大学消化内镜研究所 江苏省南京市210011
司进, 李琦雯, 渠利利, 南京医科大学第二附属医院检验科 江苏省南京市 210011
沈鹏, 在读硕士, 主要从事肝癌早期诊断多联快速胶体金试纸条的研制及性能评价.
基金项目: 南京市科技发展计划基金资助项目, No. 201104029; 江苏省医学重点人才基金资助项目, No. RC2011081; 南京市医学科技发展基金资助项目, No. ZKX11176.
作者贡献分布: 沈鹏、司进及季国忠对此文所作贡献均等; 此课题由季国忠、沈鹏及司进设计; 研究过程由季国忠、沈鹏、司进、李琦雯、渠利利、李璐蓉及严晓璐操作完成; 研究所用试剂与分析工具由季国忠提供; 数据分析由沈鹏完成; 论文写作由沈鹏、司进及季国忠完成.
通讯作者: 季国忠, 教授, 主任医师, 博士生导师, 210011, 江苏省南京市下关区姜家园121号, 南京医科大学第二附属医院消化医学中心, 南京医科大学消化内镜研究所. jgzzl@163.com
电话: 025-58509996
收稿日期: 2013-09-05
修回日期: 2013-10-21
接受日期: 2013-10-30
在线出版日期: 2013-12-18
Abstract

目的: 通过克隆、表达一种有前景的肝癌肿瘤标志物人去羟基凝血素(Des-γ-carboxy prothrombin, DCP), 制备抗DCP单克隆抗体并初步鉴定其特性.

方法: 依据DCP基因序列, 合成DCP全长基因, 构建原核表达载体pColdⅡ-DCP, 转化至Escherichia coli BL21(DE3), IPTG诱导表达, 以Ni2+亲和层析柱纯化带有His标签的DCP蛋白. 纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠, 制备抗DCP单克隆抗体. 以ELISA法检测抗体效价与亚型; Western blot和免疫组织化学染色鉴定抗体特异性.

结果: 成功表达并获得DCP蛋白, 其相对分子量约为23000; 获得1株稳定分泌抗人DCP单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5; Western blot和免疫组织化学结果显示抗人DCP单克隆抗体能与DCP发生特异性结合, 且ELISA检测抗体的效价为1:2.43×105, 其亚类为IgG2a.

结论: 成功制备了抗人DCP单克隆抗体, 为进一步将该抗体应用于肝癌的早期诊断提供了重要工具.

Keywords: 异常凝血酶原; 原核表达; 杂交瘤技术; 单克隆抗体; 肝细胞肝癌; 肿瘤标志物

核心提示: 本文以pCold Ⅱ原核表达载体诱导表达纯化6×His标签的人去羟基凝血素(Des-γ-carboxy prothrombin, DCP)重组蛋白, 为今后规模化生产提供基础; 并最终获得1株持续稳定分泌抗DCP mAb杂交瘤细胞株, 成功制备了效价高、特异性好的鼠抗人DCP单克隆抗体, 并检测了肝细胞肝癌中的DCP的表达.