修回日期: 2017-02-16
接受日期: 2017-02-27
在线出版日期: 2017-03-18
制备干扰KDM5C基因重组慢病毒载体, 观察干扰人KDM5C基因后对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及长链非编码RNA GAS5表达的影响.
设计3对针对KDM5C基因短发夹型RNA干扰序列(short hairpin RNA, shRNA)和1对阴性对照序列, 退火后连接到pLKD载体上, 经转化PCR阳性克隆筛选及测序鉴定. 使用四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒, 慢病毒包装后用孔稀释法进行滴度测定. 将慢病毒感染HepG2细胞, qRT-PCR和Western blotting检测HepG2细胞KDM5C的mRNA和蛋白表达. MTT法及细胞划痕实验检测转染Lv-shKDM5C后细胞增殖及迁移能力, 同时观察lncRNA GAS5 mRNA的表达水平变化.
PCR扩增和测序结果证明, 成功构建Lv-shKDM5C慢病毒载体. 经包装产生的3组慢病毒载体滴度: Lv-shKDM5C-1是4.95×108 TU/mL, Lv-shKDM5C-2是3.46×108 TU/mL, Lv-shKDM5C-3是3.08×108 TU/mL. 与正常肝细胞相比, 肝癌HepG2细胞KDM5C表达明显增加. 与未转染组及阴性对照组相比, 3组Lv-shKDM5C病毒感染HepG2细胞后KDM5C的mRNA及蛋白表达量均显著下降(P<0.05); 其中Lv-shKDM5C-3组下降最为明显(P<0.05), 因此选取Lv-shKDM5C-3进行后续实验. MTT结果显示Lv-shKDM5C-3转染肝癌HepG2细胞后48 h和72 h细胞生长增殖均受到抑制(P<0.05). 细胞划痕实验结果显示Lv-shKDM5C-3中细胞迁移率明显低于阴性对照组(P<0.05). qRT-PCR结果表明干扰KDM5C后lncRNA GAS5 mRNA表达显著升高(P<0.05).
本研究成功构建了特异性沉默人KDM5C基因的shRNA慢病毒载体. 将其转染肝癌HepG2后可有效抑制细胞增殖和迁移. 我们首次发现干扰KDM5C还可增加长链非编码RNA GAS5的表达.
核心提要: 检测表明肝癌HepG2细胞组蛋白去甲基化酶KDM5C表达增加; 采用短发夹型RNA干扰序列的方法成功构建有效干扰KDM5C重组慢病毒载体; 将慢病毒转染肝癌后可抑制细胞增殖、迁移并上调lncRNA GAS5的表达, KDM5C或许可以成为肝癌基因治疗的新靶点.