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肝癌细胞外泌体的分离与鉴定
陈加贵, 邓敬桓, 何敏, 广西医科大学公共卫生学院 广西壮族自治区南宁市 530021
何敏, 区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室 广西壮族自治区南宁市 530021
陈加贵, 在读硕士, 主要从事肝癌血清标志物的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81260445; 广西自然科学基金青年基金资助项目, No. 2015GXNSFBA139160; 区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室基金资助项目, Nos. GK2013-13-A-01-02, GK2014-ZZ04, GK2015-ZZ01.
作者贡献分布: 此课题由邓敬桓与何敏设计; 细胞培养、外泌体分离、鉴定由陈加贵与邓敬桓完成; 此文由陈加贵完成; 文章修改和审阅由何敏完成.
通讯作者: 何敏, 教授, 530021, 广西壮族自治区南宁市双拥路22号, 广西医科大学公共卫生学院. m_h_m868@sina.com
电话: 0771-5358146
收稿日期: 2015-12-15
修回日期: 2016-01-05
接受日期: 2016-01-11
在线出版日期: 2016-02-18
修回日期: 2016-01-05
接受日期: 2016-01-11
在线出版日期: 2016-02-18
Abstract
目的: 针对目前尚缺理想的肿瘤细胞提取方案, 探寻分离纯化肝癌细胞培养液中外泌体的新方法.
方法: 连续适应无血清培养肝癌SMMC-7721细胞, 收集细胞上清液, 采用改良超速离心法分离、纯化培养上清液中肝癌细胞外泌体; 透射电镜观察其形态, Nanosight技术分析粒径; Western blot分析其特异蛋白Alix、CD63、CD9的表达并利用SDS-PAGE电泳分析肝癌细胞和外泌体的蛋白谱.
结果: 透射电镜观察到的肝癌细胞外泌体, 外形呈圆形或椭圆形; Nanosight技术分析颗粒直径峰值为122 nm, 直径30-150 nm之间颗粒占72.16%; Western blot证实在细胞培养上清液和外泌体提取液中均能检测到Alix、CD63、CD9的蛋白表达; SDS-PAGE电泳清晰显示外泌体中高丰度大分子结构蛋白明显少于肝癌细胞.
结论: 利用连续适应无血清细胞培养结合改良超速离心法能提取高纯度的外泌体, 为肝癌细胞外泌体标志物研究奠定基础.
Keywords: 肝癌细胞; 外泌体; 分离; 鉴定
核心提示: 连续适应无血清细胞培养结合改良超速离心法是一种全新的外泌体提取方案. 本研究选取肝癌细胞, 通过多种技术, 多角度展示该方法的提取效果, 并利用SDS-PAGE电泳清晰显示蕴含的蛋白, 为肝癌细胞外泌体标志物的研究奠定基础.