基础研究
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世界华人消化杂志. 2015-09-28; 23(27): 4317-4325
Published online 2015-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v23.i27.4317
构建Tet-on调控稳定表达肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的人类MSCs细胞株
肖江强, 施晓雷, 袁献温, 丁义涛
肖江强, 南京大学医学院附属鼓楼医院消化科 江苏省南京市 210008
施晓雷, 袁献温, 丁义涛, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 江苏省南京市 210008
肖江强, 住院医师, 博士, 主要从事干细胞诱导分化的研究.
作者贡献分布: 施晓雷与丁义涛负责课题设计及指导; 肖江强负责课题实施、数据分析及论文写作; 袁献温负责试剂提供、实验方法指导.
通讯作者: 丁义涛, 教授, 210008, 江苏省南京市中山路321号, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科. yitaoding@hotmail.com
电话: 025-83106666
收稿日期: 2015-04-24
修回日期: 2015-06-08
接受日期: 2015-06-15
在线出版日期: 2015-09-28
Abstract

目的: 通过慢病毒转染UE7T-13细胞, 构建Tet-on基因开关调控稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、成纤维细胞生长因子-4(fibroblast growth factor 4, FGF4)的人类骨髓间充质干细胞株.

方法: 全基因合成HGF和FGF4序列, 通过酶切、重组分别构建包含目的基因HGF、FGF4的两个慢病毒载体plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4, 包装并计算其滴度. 以UE7T-13细胞最适MOI值稀释慢病毒Lenti3.3/TR, 并转染UE7T-13细胞, 加入抗生素Zeocin筛选, 获得带有Tet-on基因调控开关的UE7T-13-TR细胞株. 采用已构建好的慢病毒plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4分别转染UE7T-13-TR细胞并经过抗生素Blasticidin筛选, 构建Tet-on调控稳定表达HGF的UE7T-13-TR-HGF细胞株和Tet-on调控稳定表达FGF4的UE7T-13-TR-FGF4细胞株. 通过Q-PCR、Western blot及ELISA在基因、蛋白及蛋白分泌水平检测目的基因HGF、FGF4的表达情况.

结果: 成功构建UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株. 经Q-PCR检测, 当Tet存在时, HGF基因在UE7T-13-TR-HGF中的表达为无Tet时的78倍; FGF4基因则超过2万倍, 且1 μg/mL的Tet为较佳浓度. Western blot及ELISA结果在蛋白表达水平及蛋白分泌水平验证了以上结果, 证明已合成的HGF及FGF4能成功分泌到细胞外.

结论: 通过慢病毒转染UE7T-13细胞, 我们成功构建出Tet可调控稳定表达HGF、FGF4细胞株(UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株), 为进一步的研究奠定了良好的实验基础.

Keywords: 骨髓间充质干细胞; 诱导分化; 基因开关; 人肝细胞; 再生医学

核心提示: 通过慢病毒转染UE7T-13细胞, 构建四环素调控基因表达系统, 达成可调控诱导干细胞定向分化的目的.