干扰和过表达热休克转录因子2对肠上皮细胞凋亡和迁移的影响

Abstract

目的: 通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术过表达和干扰肠上皮细胞热休克转录因子2(heat shock transcription factor 2, HSF2)表达, 研究不同HSF2水平对肠上皮细胞凋亡和迁移的影响.

方法: (1)选取HT-29(人结肠癌细胞株)作为研究材料, 丁酸钠(设置不同时间点/浓度)诱导细胞凋亡, MTT法检测细胞增殖活性, 流式细胞仪检测细胞凋亡、周期. 按实验结果选取最佳丁酸钠浓度及时间位点; (2)慢病毒载体介导的RNA干扰技术过表达和干扰结肠上皮细胞HSF2表达; 用倒置荧光显微镜、Western blot法检测目的基因在细胞中的转染效率; (3)细胞迁移实验(划痕法/Transwell小室)检测过表达和干扰HSF2后细胞迁移能力的改变; (4)经过表达和干扰HSF2后的细胞, 给予丁酸钠诱导凋亡, MTT法检测细胞增殖活性, 流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期.

结果: (1)MTT实验结果显示: 阴性对照组(NC组)的HT-29细胞增殖活性在实验观察期间(0-96 h)不断升高, 48 h后, 实验组的细胞对4个丁酸钠浓度组均表现出明显的生长抑制, 相对于NC组之间差异具有统计学意义(P<0.01), 故丁酸钠对HT-29细胞的生长抑制作用呈浓度、时间依赖性. 流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示: NC组有少量凋亡, 总凋亡率为0.548%±0.113%, 而实验组经4个不同浓度丁酸钠处理48 h后, 总凋亡率分别为51.588%±5.110%、77.732%±2.746%、90.115%±1.438%、94.247%±1.243%, 与NC组之间差异具有统计学意义(P<0.01). 而当丁酸钠浓度>2.5 mmol/L, 凋亡率较1.25 mmol/L明显上升. 细胞周期检测结果显示: 与NC相比, 1.25 mmol/L丁酸钠处理HT-29细胞48 h, G₀/G₁期HT-29细胞未显示出明显差异(P = 1.00>0.05), 即无明显细胞周期阻滞; 而2.5、5.0、10 mmol/L以上浓度在各观察点均出现明显的细胞周期阻滞现象, 呈明显的G₁/G₀期阻滞(P<0.01); (2)慢病毒载体转染效果检测: 通过倒置荧光显微镜(×100)观察可发现, 各组HT-29细胞经慢病毒载体转染后均有GFP表达, 转染率达80%以上. 用Western blot法检测结果显示: 慢病毒构建载体能够在细胞中高效、稳定地过表达和干扰目的基因; (3)MTT法检测转染过表达和siRNA的HSF2细胞在丁酸钠诱导凋亡环境下活性变化, 结果显示: 过表达组细胞活性高于过表达对照组(P<0.05), 干扰组的细胞活性低于干扰对照组, 差异具有统计学意义(P<0.05); (4)细胞迁移实验发现: 过表达组的细胞迁移能力较NC组明显增加, 而干扰组则明显降低(P<0.05); (5)过表达和干扰HSF2后丁酸钠诱导凋亡环境下细胞周期的影响: NC组以及使用慢病毒载体处理的5组之间, 各时间点细胞周期分布差异均无统计学意义(P>0.05); (6)过表达和干扰HSF2后丁酸钠诱导凋亡环境下细胞凋亡率的变化: 过表达组总凋亡率低于过表达对照组(P<0.05); 干扰组总凋亡率高于干扰对照组(P<0.05).

结论: 细胞发生凋亡时, HSF2可能对肠上皮细胞起保护作用, 提示HSF2可能通过调控细胞周期来实现对细胞增殖的影响, 但也可能还有其他途径; HSF2可能在凋亡损伤时对肠上皮细胞起修复作用.

Keywords: 热休克转录因子2; RNA干扰; 过表达; HT-29细胞; 凋亡; 迁移

核心提示: 通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术过表达和沉默肠上皮细胞热休克转录因子2(heat shock transcription factor 2, HSF2)表达, 研究其对肠上皮细胞凋亡和迁移的影响, 发现细胞发生凋亡时, HSF2可能对肠上皮细胞起保护作用以及修复作用; HSF2可能通过调控细胞周期来实现对细胞增殖的影响.