Published online 2014-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v22.i36.5587
修回日期: 2014-08-20
接受日期: 2014-11-18
在线出版日期: 2014-12-28
目的: 从多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)基因转录调控入手, 初步探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)上调MRP1表达的机制.
方法: (1)以人胃癌BGC-823细胞为模型, 一组常规培养24 h, 另一组VEGF作用24 h, 最后一组PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理1 h后再加VEGF作用24 h, Western blot法分别检测各实验组MRP1、Akt、p-Akt及SP1蛋白表达水平, EMSA方法检测各实验组转录因子SP1与DNA的结合活性; (2)构建分别含MRP1基因启动子序列及SP1结合位点突变的MRP1基因启动子序列的重组荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic-MRP1w、PGL3-Basic-MRP1m), 荧光素酶活性分析突变后的MRP1基因启动子在BGC-823细胞中活性的改变及VEGF对其转录活性的影响.
结果: (1)VEGF 32 ng/mL作用24 h组与未处理组相比, MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均上调, 且SP1的DNA结合活性明显增强; LY294002 50 μmol/mL预处理1 h再联合VEGF 32 ng/mL作用24 h后, 与VEGF 32 ng/mL单独作用组相比, MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均下调, SP1的DNA结合活性明显减弱; (2)在BGC-823细胞中, PGL3-Basic-MRP1m具有启动子活性(110.000±2.603), 其转录活性为空载体PGL3-Basic的1.8倍(t = -8.936, P<0.01), 但与SP1结合位点突变之前的MRP1启动子(PGL3-Basic-MRP1w)活性(144.000±6.888)相比, 其转录活性下降23.6%(t = 4.617, P<0.05); VEGF作用12 h后, 其活性增强, 且呈剂量依赖关系(r = 0.911, P<0.01), VEGF作用浓度为32 ng/mL时达最大值(191.000±14.799), 与无VEGF作用组(112.000±11.358)相比, 活性增高0.7倍(t = -7.335, P<0.01); VEGF作用24 h后, 也能以剂量依赖的方式上调SP1结合位点突变后MRP1启动子区的转录活性(r = 0.945, P<0.01), 与无VEGF作用组(133.000±6.083)相比, 最大活性(426.000±7.000)增高2.2倍(t = -56.032, P<0.01).
结论: VEGF对MRP1启动子活性的上调作用与激活PI3K/Akt信号通路及增强转录因子SP1的表达及活性相关; MRP1基因启动子区SP1结合位点突变后其启动子活性减弱, VEGF对其活性的上调作用不如突变之前明显.
核心提示: 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)对多药耐药相关蛋白1(multi-drug resistance-associated protein 1, MRP1)启动子活性的上调作用与激活PI3K/Akt信号通路及增强转录因子SP1的表达及活性相关; MRP1基因启动子区SP1结合位点突变后其启动子活性减弱, VEGF对其活性的上调作用不如突变之前明显.