Copyright
©The Author(s) 2014. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2014-05-28; 22(15): 2140-2144
Published online 2014-05-28. doi: 10.11569/wcjd.v22.i15.2140
Published online 2014-05-28. doi: 10.11569/wcjd.v22.i15.2140
人Cdc25C基因克隆及其原核表达载体的构建与表达
卓少元, 钟卫干, 广西中医药大学生物化学与分子生物学教研室 广西壮族自治区南宁市 530001
陈承晓, 农蔚霞, 黄天明, 马步国, 莫发荣, 广西医科大学组织学与胚胎学教研室 广西壮族自治区南宁市 530021
卓少元, 副教授, 主要从事肝癌的中医药防治的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81160264;肝脏保护与再生调节北京市重点实验室基金资助项目, No. 2011-2.
作者贡献分布: 此项目由莫发荣设计; 质粒构建由卓少元完成; 蛋白表达由陈承晓完成; 实验过程由钟卫干、农蔚霞、黄天明及马步国协助完成; 本论文写作由卓少元与莫发荣完成.
通讯作者: 莫发荣, 副教授, 硕士生导师, 530021, 广西壮族自治区南宁市双拥路22号, 广西医科大学组织学与胚胎学教研室. farong.mo@rwth-aachen.de
电话: 0771-5358577
收稿日期: 2014-02-17
修回日期: 2014-03-21
接受日期: 2014-03-28
在线出版日期: 2014-05-28
修回日期: 2014-03-21
接受日期: 2014-03-28
在线出版日期: 2014-05-28
Abstract
目的: 构建人Cdc25C基因的克隆载体和原核表达载体, 并诱导其在大肠杆菌中表达.
方法: 从人肝癌细胞株Bel-7404中提取总RNA, 经RT-PCR法扩增人Cdc25C cDNA后, 将其正确插入克隆载体pMD18-T和表达载体pET-32a(+), 并转化至BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Transetta(DE3)三种感受态大肠杆菌中, 分别采用0.25 mmol/L IPTG和ArtMediaTM Protein Expression自动诱导表达培养基诱导表达, 并对纯化的融合蛋白进行考马斯亮蓝染色和质谱分析鉴定.
结果: 成功扩增了Cdc25C基因, 并获得pMD18-T-Cdc25C克隆载体和pET-32a(+)-Cdc25C表达载体; 重组质粒在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Transetta(DE3)三种感受态大肠杆菌中均诱导表达出TRx-His-Cdc25C融合蛋白; 考马斯亮蓝染色和蛋白质谱分析结果显示基因重组蛋白与目的蛋白相符.
结论: 获得肿瘤相关抗原Cdc25C重组蛋白, 为后续研究奠定基础.
Keywords: 肿瘤相关抗原; 人Cdc25C; 原核表达
核心提示: 本文从肝癌cDNA文库成功扩增了肝癌相关抗原Cdc25C基因, 并正确插入pMD18-T克隆载体和pET-32a(+)表达载体. 原核表达出TRx-His-Cdc25C融合蛋白, 经蛋白质谱分析显示与目的蛋白相符.