研究快报
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世界华人消化杂志. 2014-04-08; 22(10): 1436-1441
Published online 2014-04-08. doi: 10.11569/wcjd.v22.i10.1436
A20与EGFP共表达腺病毒载体的构建及转染THP-1细胞
郭永红, 陈琳, 何瑜, 周云, 范超, 张颖, 纪光晰, 秦源, 张凌云, 贾战生
郭永红, 何瑜, 周云, 范超, 张颖, 纪光晰, 秦源, 贾战生, 第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
郭永红, 西安交通大学医学院第二附属医院感染科 陕西省西安市 710004
陈琳, 第四军医大学唐都医院质量控制科 陕西省西安市 710038
张凌云, 河南新乡医学院感染科 河南省新乡市 453000
郭永红, 副主任医师, 博士研究生, 第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心博士后, 主要从事病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的发病机制研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, Nos. 81170389, 81273218.
作者贡献分布: 此课题由郭永红、陈琳、 何瑜、周云及范超设计; 研究过程由郭永红、纪光晰及张凌云操作完成; 数据分析由秦源完成; 本论文写作由郭永红、张颖及贾战生完成.
通讯作者: 贾战生, 教授, 主任医师, 710038, 陕西省西安市灞桥区新寺路569号, 第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. jiazsh@fmmu.edu.cn
收稿日期: 2013-11-25
修回日期: 2013-12-24
接受日期: 2014-02-18
在线出版日期: 2014-04-08
Abstract

目的: 构建A20和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)共表达的腺病毒载体, 观察其对人单核-巨噬细胞系THP-1的影响.

方法: PCR扩增目的基因片段A20, 将目的基因与载体GV314连接获得重组穿梭质粒pGV314-A20, 在DH5a感受态细胞中扩增, 同源重组得到含有目的基因的腺病毒载体, 转染293T细胞, 包装成具有感染能力的共表达A20和EGFP的腺病毒颗粒, 转染目的细胞THP-1, 通过Western blot检测A20蛋白在THP-1细胞的表达, EILSA检测脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激THP-1后其上清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)的表达.

结果: 限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实重组载体构建成功, 包装的腺病毒滴度达到1×1011 pfu/mL, 感染了腺病毒后的293细胞出现了明显的气球样变, Western blot证实转染THP-1后A20蛋白表达显著增加, 与空白组比较, THP-1上清中TNF-α和IL-6的表达下降, 两者相比, 有统计学差异(P<0.05).

结论: 成功构建A20与EGFP共表达腺病毒载体, 能够在THP-1细胞表达, 降低其炎性因子表达, 为进一步研究其抗炎功能奠定基础.

Keywords: A20; 增强型绿色荧光蛋白; THP-1

核心提示: 构建A20和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)双基因表达载体, 通过A20与EGFP使用不同的启动子共表达, 通过EGFP的表达观察绿色荧光有利于观察转染率, 同时EGFP不会影响A20蛋白的表达, 转染单核-巨噬细胞系THP-1细胞上调A20表达, 观察其对炎症因子释放的影响.