临床经验
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世界华人消化杂志. 2013-03-28; 21(9): 814-819
Published online 2013-03-28. doi: 10.11569/wcjd.v21.i9.814
重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响
付冰峰, 李绍祥, 宁守斌
付冰峰, 河北北方学院 河北省张家口市 075000
李绍祥, 中国人民解放军北京军区总医院全军肝病治疗中心 北京市 100700
宁守斌, 中国人民解放军空军总医院消化科 北京市 100142
付冰峰, 硕士, 主要从事乙型肝炎相关的基础研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30872353; 北京军区十一五计划基金资助项目, No. 06BJ020.
作者贡献分布: 此课题设计由李绍祥完成; 付冰峰完成实验主要内容, 并归纳整理; 宁守斌负责信息采集.
通讯作者: 李绍祥, 副主任医师, 100700, 北京市东城区东四十条南门仓5号, 中国人民解放军北京军区总医院全军肝病治疗中心. shxili@163.com
收稿日期: 2013-01-16
修回日期: 2013-02-16
接受日期: 2013-03-05
在线出版日期: 2013-03-28
Abstract

目的: 观察以重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制和表达的影响.

方法: 将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)的2个ITR(inverted terminal repeat, ITR)之间, 之后接有HBV的基本核心启动子(bacic core promoter, BCP)及其驱动的AAV的Rep基因, 构成rAAV, 作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体, 转染HepG2.2.15细胞(肝细胞性肝癌细胞插入乙型肝炎病毒基因), 测定上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg表达及HBV DNA拷贝数, 并对细胞基因组AAVS1区域进行测序.

结果: 成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322-324、PLRBR522-324、PLRBR322-2424、PLRBR522-2424. 体外质粒转染细胞实验显示4个载体对HBsAg、HBeAg表达及HBV DNA复制均有抑制效应, 且前两者对HBsAg高一些、后两者对HBeAg高一些, 第3个对HBV DNA拷贝数高一些. 转染后第3天后抑制效应最明显, 第10天抑制率仍较高. 针对细胞基因组AAVS1区域测序结果显示, 目的序列定点整合于该区域.

结论: 利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体, 借助Rep蛋白介导的定点整合作用, 为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索.

Keywords: RNA干扰; 短发夹RNA; rAAV; HepG2.2.15细胞; 定点整合