基础研究
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世界华人消化杂志. 2013-07-28; 21(21): 2016-2022
Published online 2013-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v21.i21.2016
pHBx-EGFP载体构建及其在肝癌Bel 7402细胞中的表达
李伟, 朱明月, 鲁琰, 朱丽琴, 董栩, 陈栘, 李孟森
李伟, 朱明月, 鲁琰, 朱丽琴, 董栩, 陈栘, 李孟森, 海南医学院肿瘤发生和干预重点实验室 海南省海口市 571199
李伟, 朱明月, 鲁琰, 董栩, 陈栘, 李孟森, 海南医学院分子生物学重点实验室 海南省海口市 571199
朱丽琴, 海南医学院基础医学院生物科学 海南省海口市 571199
李伟, 助理研究员, 主要从事肿瘤分子生物学方面的研究.
作者贡献分布: 李伟负责构建载体并转染细胞、检测蛋白质表达; 朱明月负责载体序列的测定和载体在细胞定位的观测; 鲁琰负责细胞培养, 检测载体的表达; 朱丽琴负责构建载体和转染细胞, 检测载体的表达; 董栩负责PCR引物的设计, 扩增载体的DNA以及酶切电泳; 陈栘负责细胞培养和研究数据的分析; 李孟森负责研究内容的设计与数据分析; 本论文写作由李伟与李孟森完成.
通讯作者: 李孟森, 研究员, 571199, 海南省海口市龙华区学院路3号, 海南省肿瘤发生和干预重点实验室, 海南医学院分子生物学重点实验室. mengsenli@163.com
电话: 0898-66893780
收稿日期: 2013-05-22
修回日期: 2013-06-09
接受日期: 2013-07-03
在线出版日期: 2013-07-28
Abstract

目的: 构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)-X蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)真核融合蛋白表达载体(pHBx-EGFP), 转染肝癌Bel 7402细胞, 观察其表达和定位, 为进一步研究HBx功能提供工具.

方法: 以pcDNA3.1-HBx为模板, 应用PCR和DNA重组技术构建增强型绿色荧光蛋白HBx-EGFP融合蛋白表达载体pHBx-EGFP, 经脂质体转染Bel 7402细胞, 应用倒置荧光显微镜观察融合蛋白表达和定位; 同时提取转染pHBx-EGFP 24 h后的Bel 7402细胞总蛋白, 应用Western blot技术, 鉴定HBx在细胞的表达情况.

结果: 成功扩增HBx片段插入pEGFP载体, 经酶切验证后测序正确; pHBx-EGFP转染Bel 7402细胞24 h后, 荧光显微镜下观察显示HBx-EGFP存在于细胞核周区域, 而EGFP则弥散分布于整个细胞; Western blot得到HBx-EGFP、EGFP和HBx目的条带.

结论: 成功构建pHBx-EGFP真核重组蛋白表达载体, 通过检测绿色荧光蛋白标记显示其在Bel 7402细胞中表达及定位, 并证实pHBx-EGFP载体能在Bel 7402细胞正确表达.

Keywords: 肝癌细胞; 乙型肝炎病毒x基因; 增强型绿色荧光蛋白

核心提示: 本研究成功构建pHBx-EGFP真核重组蛋白表达载体, 通过检测绿色荧光蛋白标记显示其在Bel 7402细胞中表达及定位, 并通过Western blot证实pHBx-EGFP载体能在Bel 7402细胞内正确表达. 将为研究HBx在肝癌发生过程中的作用机制奠定前期的工作基础.