临床研究
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世界华人消化杂志. 2013-04-08; 21(10): 858-864
Published online 2013-04-08. doi: 10.11569/wcjd.v21.i10.858
基于去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞磁性分选检测法及其改良
余锋, 陈磊, 徐文, 曹璐, 张妤, 施乐华, 殷正丰
余锋, 陈磊, 徐文, 曹璐, 张妤, 施乐华, 殷正丰, 上海第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室 上海市 200438
余锋, 中国人民解放军第101中心医院肝胆外科 江苏省无锡市 214044
余锋, 主治医师, 主要从事肝胆疾病的外科治疗.
基金项目: 国家863基金资助项目, No. 2007AA02Z461; 国家科技重大专项基金资助项目, No. 2012ZX10002021.
作者贡献分布: 此课题由余锋、施乐华及殷正丰设计; 研究过程由陈磊、徐文、曹璐及张妤操作完成; 研究所用试剂与实验材料由殷正丰提供; 数据分析由余锋完成; 本论文写作由余锋与殷正丰共同完成.
通讯作者: 殷正丰, 教授, 200438, 上海市杨浦区长海路225号, 上海第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室. yinzfk@yahoo.com.cn
收稿日期: 2013-01-22
修回日期: 2013-02-18
接受日期: 2013-03-15
在线出版日期: 2013-04-08
Abstract

目的: 介绍一种肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)富集和检测系统, 并对该系统进行改良, 以提高循环肿瘤细胞的检出率.

方法: 去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)是一种特异表达于肝实质细胞膜的跨膜蛋白. 我们建立了一种基于ASGPR的磁性分选和Hep par 1免疫鉴定的循环肝癌细胞富集和计数系统. 首先以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合, 然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记, 从而磁性捕获循环肝癌细胞, 接着用Hep par 1进行免疫荧光染色鉴定, 并对阳性细胞进行计数. 文献报道和实际操作中发现, 检测过程中采用肝素抗凝会引起细胞悬液中出现凝胶, 影响细胞通过分离柱, 降低分离效率. 我们将部分步骤改用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)替代肝素抗凝, 采用Hep3B肝癌细胞掺入试验对两种方法回收情况进行比较.

结果: 部分步骤改用EDTA抗凝后, 细胞悬液中未出现凝胶现象. 细胞掺入试验显示, 5 mL健康志愿者外周血中分别掺入10、30、90、270和810个Hep3B细胞, 在每个掺入水平, 改良法Hep3B细胞的平均回收率均≥70%, 回收效率明显增加(P<0.05).

结论: 基于ASGPR的循环肝癌细胞富集和计数系统是一种具有临床应用潜能的循环肝癌细胞检测方法. 经改良后能够有效消除细胞悬液中凝胶形成的现象, 肝癌细胞回收效率较原检测法明显提高.

Keywords: 循环肿瘤细胞; 去唾液酸糖蛋白受体; 肝细胞癌

核心提示: 介绍并改良一种基于肝细胞膜表面去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞富集和检测系统. 改良系统具有高度的敏感性和特异性. 该系统有望在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的早期诊断、预测转移复发、疗效监测以及筛选HCC肝移植受者等方面得到临床应用. 并有可能成为一个重要的技术平台, 推动HCC临床应用研究和基础研究的进步.