基础研究
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世界华人消化杂志. 2012-09-18; 20(26): 2453-2459
Published online 2012-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i26.2453
pCMV-HSF2-FLAG重组质粒的构建及其在Caco-2细胞中的表达
缪应雷, 牛俊坤, 周丽峰, 童明霞
缪应雷, 牛俊坤, 周丽峰, 昆明医科大学第一附属医院消化内科 云南省昆明市 650032
童明霞, 南充市中心医院消化内科 四川省南充市 637000
缪应雷, 博士, 教授, 主任医师, 主要从事炎症性肠病发病机制及诊断治疗方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81160055; 云南省科技厅-昆明医学院联合专项基金资助项目, No. 2011FB183; No. 2007C0010R.
作者贡献分布: 此课题由缪应雷设计; 研究所用试剂由缪应雷提供; 研究过程由缪应雷、牛俊坤、周丽峰及童明霞共同操作完成; 论文写作由缪应雷与牛俊坤完成.
通讯作者: 缪应雷, 教授, 650032, 云南省昆明市西昌路295号, 昆明医科大学第一附属医院消化内科. myldu@sina.com.cn
电话: 0871-5324888-2532
收稿日期: 2012-04-30
修回日期: 2012-08-10
接受日期: 2012-08-21
在线出版日期: 2012-09-18
Abstract

目的: 构建人HSF2 pCMV-Myc真核表达载体, 研究其在人结肠上皮肿瘤细胞Caco-2内的表达和定位.

方法: 以HSF2 Human cDNA ORF clone为模板, PCR法扩增出全长HSF2编码系列, 用EcoRⅠ和KpnⅠ对HSF2 PCR纯化产物双酶切后, 采用基因重组技术将其插入至pCMV-Myc载体中. DNA测序正确后, 脂质体法将重组质粒转染到Caco-2细胞内, 提取细胞总RNA逆转录为cDNA后进行普通PCR检测HSF2 mRNA转录水平, 提取细胞蛋白进行Western blot检测HSF2蛋白质水平及融合蛋白表达. 采用激光共聚焦显微镜观察HSF2及融合蛋白在Caco-2内的表达和定位.

结果: 将人全长HSF2编码序列克隆到真核表达载体pCMV-Myc中, 酶切鉴定片段为1 557 bp, 重组质粒测序正确. 转染重组质粒后, PCR显示HSF2在mRNA水平较未转染组和空载组升高; Western blot检测到融合蛋白正确表达, 分子量约为70 kDa. 与未转染组和空载组相比, 重组质粒组HSF2蛋白质水平明显升高. 激光共聚焦显微镜下观察到HSF2和融合蛋白定位一致, 主要分布于Caco-2细胞质中, 少量聚集在细胞核膜.

结论: 成功构建了人全长HSF2编码序列的pCMV-HSF2-FLAG真核表达载体, 并在Caco-2细胞中成功表达, 为进一步研究HSF2在溃疡性结肠炎中的作用奠定了良好的基础.

Keywords: 热休克转录因子2; 基因重组; 真核表达; Caco-2; 溃疡性结肠炎