研究快报
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世界华人消化杂志. 2012-09-08; 20(25): 2397-2403
Published online 2012-09-08. doi: 10.11569/wcjd.v20.i25.2397
TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut及稳定转染细胞株的构建
方媛媛, 苏红, 周慧敏, 林
方媛媛, 周慧敏, 林, 苏 红, 中山大学孙逸仙纪念医院消化内科 广东省广州市 510120
林, 中山大学孙逸仙纪念医院 恶性肿瘤基因调控与靶向治疗广东普通高校重点实验室 广东省广州市 510120
方媛媛, 在读硕士, 主要从事消化系统疾病的研究.
基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金资助项目, No. 30901782; 中央高校基本科研业务费专项基金资助项目, No. 11ykpy32.
作者贡献分布: 此课题由方媛媛、苏红、周慧敏及林设计; 实验过程由方媛媛与周慧敏完成; 研究所用试剂及分析工具由林与苏红提供; 数据分析由方媛媛、苏红、周慧敏及林完成; 本论文写作由方媛媛、苏红、周慧敏及林完成.
通讯作者: 林, 副主任医师, 510120, 广东省广州市沿江西路107号, 中山大学孙逸仙纪念医院消化内科, 恶性肿瘤基因调控与靶向治疗广东普通高校重点实验室. linwy@mail.sysu.edu.cn
电话: 020-81332598
收稿日期: 2012-06-27
修回日期: 2012-08-03
接受日期: 2012-08-06
在线出版日期: 2012-09-08
Abstract

目的: 构建携tagln基因的真核表达载体, 建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.

方法: 通过Gateway克隆技术, 使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应, 产生入门克隆, 再与pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-DEST空载体进行LR重组反应, 生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut. 通过测序验证目的质粒的插入序列. 将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO. 通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平. 通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.

结果: 携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确; 实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示, 稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调, 差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1, P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04, P<0.01). 细胞侵袭实验提示, RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%, P<0.01).

结论: 成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株, 为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.

Keywords: Transgelin; 结肠癌; 人结肠癌细胞RKO; Gateway克隆技术