研究快报
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世界华人消化杂志. 2011-02-08; 19(4): 400-403
Published online 2011-02-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i4.400
类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B酵母双杂交cDNA文库的构建
余新, 刘天, 德洪波, 李国惠, 邵江华
余新, 刘天, 德洪波, 李国惠, 邵江华, 南昌大学第二附属医院肝胆外科 江西省南昌市 330006
基金项目: 教育部科学技术研究重点基金资助项目, No. 208070;江西省教育厅科学技术研究重点基金资助项目, No. GJJ08003;江西省卫生厅一般基金资助项目, No. 2008411.
作者贡献分布: 此课题由余新与邵江华设计; 研究过程由余新、刘天德及洪波操作完成; 数据分析由余新与李国惠完成; 本文撰写由余新与邵江华完成.
通讯作者: 邵江华, 教授, 330006, 江西省南昌市, 南昌大学第二附属医院肝胆外科. shao5022@163.com
收稿日期: 2009-08-19
修回日期: 2010-03-29
接受日期: 2010-04-07
在线出版日期: 2011-02-08
Abstract

目的: 构建类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B的酵母双杂交用cDNA文库.

方法: 从肝癌细胞Hep3B中提取总RNA, 分离mRNA. 利用反转录酶M-MLV与Oligo(dT) Anchor Primer合成1st Strand cDNA, 用E.coli DNA Polymerase与E.coli DNA Ligase将RNA链置换成DNA链, 合成2nd Strand cDNA. 将双链cDNA与EcoRⅠ Adaptor连接, 然后用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切. 使用Spin Column除去短链cDNA与pGADT7载体连接, 转化入E.coli DH10B, 建成原始文库. 然后对其进行扩增并随机挑取单菌落, 酶切鉴定重组子插入片段大小.

结果: 提取的总RNA降解少且分子完整; RNA纯度高, 相对分子质量为400-5000 bp; 成功合成双链cDNA, 均符合建库要求; 库容量达到1.03×106克隆, 原始文库滴度为2.50×109 cfu/L, 扩增后的文库滴度为3.60×1012 cfu/L. 插入片段大小分布为0.5-3.5 kb, 平均长度约为2.0 kb.

结论: 所构建文库的各项指标均达到要求, 为筛选FAT10作用蛋白奠定了重要基础.

Keywords: 人肝癌细胞Hep3B; 酵母双杂交cDNA文库; FAT10