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世界华人消化杂志. 2011-09-08; 19(25): 2637-2643
Published online 2011-09-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i25.2637
Published online 2011-09-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i25.2637
TRAF6 shRNA对LPS/TLR4信号传导通路的体外干预作用
陈锋, 孙继民, 武汉市妇女儿童医疗保健中心急救科 湖北省武汉市 430015
何生松, 庞然, 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科 湖北省武汉市 430022
许娟娟, 华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科 湖北省武汉市 430022
董继华, 华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室 湖北省武汉市 430022
陈锋, 2010年毕业于华中科技大学同济医学院, 获医学博士学位, 主要从事病毒性肝炎及肝衰竭的病因机制研究.
作者贡献分布: 孙继民、何生松及陈锋对此文所作贡献均等; 此课题设计由陈锋与何生松设计完成; 研究过程由陈锋、庞然及许娟娟操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由董继华、何生松与孙继民提供; 数据分析及本论文写作由陈锋完成; 孙继民与何生松修改校正.
通讯作者: 孙继民, 主任医师, 430015, 湖北省武汉市江岸区香港路100号, 武汉市妇女儿童医疗保健中心急救科. sunjimin@163.com
收稿日期: 2011-08-09
修回日期: 2011-08-19
接受日期: 2011-09-01
在线出版日期: 2011-09-08
修回日期: 2011-08-19
接受日期: 2011-09-01
在线出版日期: 2011-09-08
Abstract
目的: 体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因TRAF6的表达对RAW264.7细胞增殖的影响, 初步探讨TRAF6-shRNA对LPS/TLR4胞内信号转导的影响.
方法: 构建靶向抑制小鼠TRAF6的shRNA的真核表达载体, 转染RAW264.7细胞后培养48 h, 予以终浓度为100 ng/mL的LPS刺激, 0、4、8 h和16 h后收集细胞上清, 同时设空白对照及地塞米松阳性对照组, ELISA法测定上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1, Real-time PCR方法检测TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA, Western blot检测细胞核内NF-κB p65.
结果: 转染TRAF6-shRNA 48 h后, TRAF6 mRNA及蛋白表达明显受到抑制, 其抑制率分别为79.17%、68.74%. MTT法检测结果显示, 重组质粒转染72 h内对细胞增殖无明显的抑制. LPS刺激后, TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达量都有明显变化(P<0.01), 其中TNF-α、IL-1β在8 h达高峰, TGF-β1在16 h达高峰, TRAF6 基因沉默后, 以上细胞因子增长率明都显下降(P<0.01). 实验结果显示, TRAF6基因沉默明显能下调IL-6、COX-2 mRNA表达, 并能抑制LPS激活的NF-κB核转位.
结论: 重组质粒TRAF6-shRNA能有效降低RAW264.7细胞中基因TRAF6 mRNA及蛋白的表达, 并对内毒素炎症反应具有明显的抑制效应.
Keywords: 肿瘤坏死因子受体相关因子6; RNA干扰; 细菌脂多糖; Toll样受体4信号通路; 核因子-κB