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世界华人消化杂志. 2011-04-18; 19(11): 1179-1183
Published online 2011-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v19.i11.1179
Published online 2011-04-18. doi: 10.11569/wcjd.v19.i11.1179
靶向Slug基因的腺相关腺病毒载体的构建与鉴定
严明总, 海南省人民医院检验科 海南省海口市 527102
张克君, 欧树安, 海南医学院附属医院普外科 海南省海口市 527000
王齐全, 海口市人民医院消化内科 海南省海口市 527102
作者贡献分布: 本课题由严明总、王齐全及欧树安共同设计、共同试验操作; 严明总进行论文写作和统计; 张克君进行技术指导.
通讯作者: 严明总, 527102, 海南省海口市, 海南省人民医院检验科. wlsdermyy@163.com
电话: 0898-88069558
收稿日期: 2009-11-26
修回日期: 2011-04-14
接受日期: 2011-04-18
在线出版日期: 2011-04-18
修回日期: 2011-04-14
接受日期: 2011-04-18
在线出版日期: 2011-04-18
Abstract
目的: 构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.
方法: 首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒, 以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段, EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收的PCR产物; 酶切pSNAV2.0-lacz-α载体质粒, 并与上述产物进行连接; 转化感受态大肠杆菌DH5α, 得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA, 酶切和测序对其进行鉴定. 建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA, 大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴定和滴度测定.
结果: 携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA, 经PCR、酶切和测序鉴定, 质粒构建正确. 将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-2, 成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA, 经检测目的片段插入成功, 滴度为9.23×1010 puf.
结论: 成功制备出高滴度的携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.
Keywords: Slug基因; 小干扰RNA; 重组腺相关腺病毒