Published online 2010-12-18. doi: 10.11569/wcjd.v18.i35.3724
修回日期: 2010-11-16
接受日期: 2010-11-23
在线出版日期: 2010-12-18
目的: 研究survivin在活化的肝星状细胞(HSC)中的表达及反义寡核苷酸(ASODN)对HSC-T6细胞株凋亡的影响.
方法: 实验设置空白对照组(脂质体和寡核苷酸均不加), 空脂质体组(只加脂质体不加寡核苷酸), 正义链转染对照组(SODN 1 000 nmol/L)和不同浓度的反义链转染组(ASODN分为400、800和1 000 nmol/L组), 共6组. 用细胞免疫荧光检测survivin在活化的HSC中的表达, 并以肝癌细胞和肝细胞为对照. 脂质体介导survivin寡核苷酸(ODN)转染HSC-T6细胞6 h后, 倒置荧光纤维镜下观察转染效率. survivin的ODN转染HSC-T6细胞48 h后, 通过RT-PCR, Western blot检测survivin基因表达的改变, PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡率.
结果: 细胞免疫荧光显示survivin在活化的HSC中高表达, 其阳性率明显高于肝细胞, 两者比较有显著性差异(66.07%±8.55% vs 9.74%±2.68%, P<0.05). 在肝癌细胞中表达率最高, 阳性率可达69.41%±9.10%. 倒置荧光显微镜下观察可见, ASODN各浓度组细胞内均可见到清晰的绿色荧光, 转染效率均达到80%. RT-PCR及Western blot结果显示: 与空白组、空脂质体组、SODN组比较, ASODN各浓度组survivin mRNA(分别为0.94±0.03, 0.95±0.04, 0.92±0.04, 0.64±0.02, 0.54±0.02和0.26±0.01)及蛋白表达(分别为0.84±0.02, 0.82±0.03, 0.81±0.02, 0.53±0.02, 0.38±0.01和0.20±0.01)均低于各对照组, 且差异有显著性(均P<0.01); PI单染流式细胞仪检测显示: 与空白组、脂质体组、SODN组比较, ASODN各浓度组的细胞凋亡率明显提高(19.00%±0.53%, 29.80%±1.54%, 48.70%±2.00% vs 5.21%±0.41%, 5.24%±2.23%, 6.35%±1.95%; 均P<0.01), 以上检测指标呈剂量依赖性. 且空白对照组、空脂质体组、SODN组(1 000 nmol/L)之间比较无统计学差异(均P>0.05).
结论: survivin在活化的HSC中有明显表达, 可能与活化的HSC中抑凋亡基因survivin过度表达有关. 因此, 抑制survivin表达就能抑制激活的HSC增殖、促进其凋亡. survivin ASODN能下调HSC-T6细胞中survivin基因的表达, 从而诱导HSC-T6细胞的凋亡.