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IRAK-M短发夹RNA对RAW264.7细胞内毒素耐受性的抑制作用
李旭宏, 重庆三峡中心医院肝胆外科 重庆市 404000
陈先锋, 游海波, 刘海忠, 刘作金, 龚建平, 重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 重庆市 400010
李旭宏, 2002级重庆医科大学外科博士, 主要从事感染信号转导机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30471696, No. 30500473.
作者贡献分布: 本课题由刘作金与龚建平设计; 研究过程由李旭宏, 陈先锋, 游海波, 刘海忠及刘作金操作完成; 数据分析及论文写作由李旭宏完成.
通讯作者: 龚建平, 400010, 重庆市渝中区临江路74号, 重庆医科大学附属第二医院肝胆外科. gongjianping11@hotmail.com
电话: 023-63036701
收稿日期: 2008-12-09
修回日期: 2009-01-16
接受日期: 2009-01-19
在线出版日期: 2009-02-18
修回日期: 2009-01-16
接受日期: 2009-01-19
在线出版日期: 2009-02-18
Abstract
目的: 观察白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因沉寂后RAW264.7细胞内毒素耐受性的改变, 进而探讨IRAK-M在内毒素耐受形成中的作用.
方法: 构建表达IRAK-M短发夹RNA(shRNA)的阳性重组质粒(pshIRAK-M-A)和阴性重组质粒(pshIRAK-M-B), 转染RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞; 各组细胞经10 μg/L脂多糖(LPS)预处理24 h后(或直接)用100 μg/L LPS刺激; 3 h后, 酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中TNF-α水平, 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中的TNF-α mRNA表达水平, 蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中IRAK-M蛋白的表达, 凝胶电迁移率分析法(EMSA)检测细胞中NF-κB的活性.
结果: pshIRAK-M-A对IRAK-M蛋白表达抑制率为83%左右, pshIRAK-M-B对IRAK-M蛋白表达无明显抑制作用; 两种转染细胞在用100 μg/L LPS直接刺激后, 其培养液中TNF-α水平、细胞内TNF-α mRNA表达及NF-κB活性无显著性差异; 两种转染细胞对LPS的再次应答均明显弱于初次应答细胞(P<0.05), 但pshIRAK-M-A转染组细胞对LPS的再次应答明显强于pshIRAK-M-B转染组细胞(P<0.05).
结论: IRAK-M表达受抑导致细胞内毒素耐受性减弱, IRAK-M在内毒素耐受形成中起重要作用.
Keywords: RAW264.7细胞; 内毒素耐受; 白介素-1受体相关激酶-M; 凝胶电迁移率分析法