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世界华人消化杂志. 2009-05-18; 17(14): 1406-1411
Published online 2009-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i14.1406
Published online 2009-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i14.1406
小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达
陈锋, 何生松, 邱荣元, 庞然, 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科 湖北省武汉市 430022
许娟娟, 华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科 湖北省武汉市 430022
董继华, 华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室 湖北省武汉市 430022
陈锋, 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科在读博士, 主要从事病毒性肝炎及肝衰竭的病因机制研究.
作者贡献分布: 何生松与陈锋对此文所作贡献均等; 此课题设计由陈锋与何生松完成; 研究过程由陈锋、邱荣元、庞然及许娟娟操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由董继华与何生松提供; 数据分析及本论文写作由陈锋完成; 何生松修改校正.
通讯作者: 何生松, 教授, 430022, 湖北省武汉市解放大道1277号, 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科. shengshe168@yahoo.com.cn
电话: 027-85726132
收稿日期: 2009-03-04
修回日期: 2009-04-15
接受日期: 2009-04-27
在线出版日期: 2009-05-18
修回日期: 2009-04-15
接受日期: 2009-04-27
在线出版日期: 2009-05-18
Abstract
目的: 构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.
方法: 针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列, 经退火成互补双链, 将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中, 构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1, 2, 3, 4, 并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中, 观察转染效果.
结果: 靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1, 2, 3, 4, 经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 证实载体构建成功. 应用荧光显微镜分析转染效率显示, DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%, 以2∶5为最佳比例. 只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.
结论: TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功, 为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.
Keywords: 肿瘤坏死因子受体相关因子6; RNA干扰; 重组表达质粒; 短发卡RNA