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Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定
印安宁, 江应安, 张险峰, 武汉大学人民医院消化内科 湖北省消化疾病省重点实验室 湖北省武汉市 430060
印安宁, 武汉大学人民医院在读博士, 主要从事消化系肿瘤防治的研究.
作者贡献分布: 印安宁与江应安对此文所作贡献均等; 此课题由印安宁、江应安及张险峰设计; 研究过程、数据分析由印安宁与张险峰操作完成; 本论文写作由印安宁与江应安完成.
通讯作者: 江应安, 教授, 430060, 武汉大学人民医院消化内科, 湖北省消化疾病省重点实验室. jiangya_cn@yahoo.com.cn
电话: 027-88041911
收稿日期: 2009-01-15
修回日期: 2009-02-27
接受日期: 2009-03-02
在线出版日期: 2009-04-08
修回日期: 2009-02-27
接受日期: 2009-03-02
在线出版日期: 2009-04-08
Abstract
目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.
方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480. G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆, 应用Western blot检测FADD的表达水平.
结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.
结论: 成功构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.
Keywords: Fas相关死亡结构域蛋白; 真核表达; 绿色荧光蛋白; 稳定转染