基础研究
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世界华人消化杂志. 2008-02-18; 16(5): 479-483
Published online 2008-02-18. doi: 10.11569/wcjd.v16.i5.479
重叠延伸PCR法克隆重组复合干扰素
刘顺爱, 浅野龙太郎, 郭晶晶, 刘志英, 余康康, 徐道振
刘顺爱, 郭晶晶, 刘志英, 余康康, 徐道振, 北京地坛医院 北京市 100011
刘顺爱, 北京大学人类疾病基因研究中心 北京市 100083
浅野龙太郎, 日本东北大学大学院生物工学蛋白质研究室 仙台市 983-0833 日本
刘顺爱, 硕士, 副研究员, 主要从事感染免疫学研究.
基金项目: 北京市优秀人才培养专项基金资助项目; 北京市卫生局科研基金资助项目; 北京市自然科学基金资助项目, No. 7042028.
作者贡献分布: 刘顺爱和浅野龙太郎对此文所作贡献均等; 此课题由刘顺爱, 浅野龙太郎, 徐道振设计; 研究过程由刘顺爱, 浅野龙太郎, 郭晶晶, 刘志英, 余康康操作完成; 数据分析由刘顺爱, 浅野龙太郎, 徐道振完成; 本论文写作由刘顺爱完成.
通讯作者: 刘顺爱, 100011, 北京东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. liusa1031@sina.com
电话: 010-64211031-2358
收稿日期: 2007-09-14
修回日期: 2008-01-15
接受日期: 2008-01-22
在线出版日期: 2008-02-18
Abstract

目的: 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人工优化的干扰素-重组复合干扰素(consensus interferon, cIFN)基因, 用原核表达系统对其进行表达, 鉴定表达的cIFN活性. 

方法:  根据大肠杆菌的偏爱密码子, 人工设计cIFN的高表达基因, 用overlap PCR法合成cIFN全基因, 用基因重组技术构建其原核表达载体pRA-cIFN, 在大肠杆菌BL21中进行高效表达, 用SDS-PAGE和Western blotting鉴定cIFN表达, 用GuHCl阶段透析法进行蛋白变性、复性, 用TALON(His)6亲和层析柱进行纯化, 用ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验检测cIFN的免疫活性和生物活性. 

结果: 成功合成了cIFN全基因, 其DNA长度与理论长度534 bp相符; 用基因重组技术成功构建了cIFN原核表达载体pRA-cIFN, 并用大肠杆菌BL21进行了高效表达, SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果显示, 表达蛋白主要以包涵体形式存在, 其分子质量符合理论值23.3 kDa; 用GuHCl阶段透析法成功进行包涵体蛋白的复性, 亲和层析法纯化后cIFN的ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验结果显示, 表达蛋白具有明显的cIFN免疫学活性、剂量依赖性PLC/PRF/5细胞增殖抑制作用和HBsAg分泌抑制作用.

结论:  重叠延伸PCR法是获得重组复合基因的有效简便的方法, 我们通过重叠延伸PCR法获得并表达的cIFN具有明显的抗病毒、抗细胞增殖活性.

Keywords: 重组复合干扰素; 重叠延伸PCR; 原核表达; 活性鉴定