Published online 2007-06-08. doi: 10.11569/wcjd.v15.i16.1788
修回日期: 2007-03-21
接受日期: 2007-03-31
在线出版日期: 2007-06-08
目的: 研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响, 探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.
方法: Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7 d, 细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0, 10, 100 μg/L)继续培养24 h, 提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架, Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量, 并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位, 实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.
结果: 免疫荧光染色可见对照组claudin-1沿细胞膜分布, 呈蜂巢状线性荧光, 10 μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱, 并呈锯齿状异常分布; Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式, 一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1), 主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中; 另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1), 只存在于NP-40不溶性蛋白样品中. TNF-α不影响20 kDa claudin-1蛋白的表达, 但可使25 kDa claudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10, 100 μg/L: 0.31±0.02, 0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P>0.05, P<0.05); 实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10, 100 μg/L)作用24 h或100 μg/L TNF-α作用不同时间(4, 8和24 h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.
结论: TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响, 但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.