Published online 2007-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v15.i14.1602
修回日期: 2007-02-01
接受日期: 2007-02-13
在线出版日期: 2007-05-18
目的: 构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒, 研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)活化、增殖、凋亡、分泌细胞外基质(ECM)的影响.
方法: 以NOV为目的基因, 以质粒psiRNA-hH1neo为载体, 构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA (psiRNA1, 2, 3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA. 限制性酶切和测序鉴定构建成功后, 脂质体介导重组质粒转染HSC, 依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组, 并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组. 半定量RT-PCR检测HSC的NOV、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达情况, Western blot检测α-SMA蛋白表达, MTT法检测细胞增殖, 流式细胞仪分析细胞凋亡.
结果: 限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOVsiRNA表达质粒; 与阴性对照组相比, 转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV、α-SMA的mRNA表达水平下降(73.0% vs 23.2%, 51.4% vs 15.1%, 均P<0.05), Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显下降(59.8% vs 17.0%, 37.1% vs 6.6%, P<0.05), α-SMA蛋白表达水平下降. 与空白对照组相比, 转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内HSC增殖活性显著降低(24 h: 0.172±0.005 vs 0.318±0.018, P<0.05; 48 h: 0.296±0.004 vs 0.472±0.029, P<0.05; 72 h: 0.432±0.024 vs 0.672±0.050, P<0.05). psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV mRNA、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达及HSC增殖活性均无明显下降(均P>0.05).
结论: NOV可促进HSC增殖、活化及分泌细胞外基质, 提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点.