基础研究
Copyright ©The Author(s) 2007. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2007-05-08; 15(13): 1494-1499
Published online 2007-05-08. doi: 10.11569/wcjd.v15.i13.1494
人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因原核表达及活性鉴定
傅蕾, 彭仕芳, 谭德明, 刘洪波
傅蕾, 彭仕芳, 谭德明, 刘洪波, 中南大学湘雅医院感染病科 湖南省长沙市 410008
傅蕾, 2005年中南大学医学博士, 主治医师, 主要从事肝功能衰竭临床与基础的研究.
基金项目: 湖南省自然科学基金资助项目, No. 05JJ30178.
通讯作者: 谭德明, 410008, 湖南省长沙市湘雅路87号, 中南大学湘雅医院感染病科. dmt2008@yahoo.com.cn
电话: 0731-4327221 传真: 0731-4327281
收稿日期: 2007-01-10
修回日期: 2007-02-04
接受日期: 2007-03-06
在线出版日期: 2007-05-08
Abstract

目的: 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的原核表达质粒, 诱导sTNFR1-MBP融合蛋白表达, 观察表达产物的生物学活性.

方法: 以HeLa细胞的总RNA为模板, 用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段, 构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆, 经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1, 以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白, 并对重组蛋白进行序列分析和Western blot鉴定. MTT法测定重组蛋白的生物学活性的测定.

结果: 经DNA序列分析和Western blot鉴定, 成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌; 在IPTG的诱导下, 重组质粒菌能表达sTNFR1-MBP融合蛋白, SDS-PAGE显示在66 kDa处有一特异性表达条带; 纯化的sTNFR1-MBP融合蛋白经Western blot证实具有生物学活性; 生物活性实验(MTT法)显示可有效地封闭TNF-α对QSG7701的细胞毒性作用, 随着重组蛋白浓度的增高(0.2, 2, 20, 40, 80 mg/L), 对TNF-α细胞毒效应的抑制作用增强, 细胞死亡率依次为69.98%±1.52%, 60.05%±2.18%, 46.27%±2.48%, 37.02%±3.17%, 1.83%±0.59%, 1.71%±0.61%.

结论: 成功获得了具有生物学活性的人sTNFR1-MBP融合蛋白, 为进一步研究奠定了基础.

Keywords: 人可溶性肿瘤病坏死因子受体1; 原核表达; 免疫印迹; 细胞毒性作用