化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA对CCl4诱导肝纤维化动物模型的影响

Abstract

目的: 研究化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)小干扰RNA(siRNA)对CCl₄诱导的大鼠肝纤维化的影响及其作用机制.

方法: SD大鼠42只随机平均分成7组:正常组、阴性对照组、假手术组、模型组, 治疗组(分3组, 分别用0.05、0.1、0.2 mg/kg siRNA尾静脉注射). 以400 mL/L CCl₄(3 μL/g) sc诱导大鼠肝纤维化. 8 wk后所有动物取肝组织标本, 测门静脉血压(PVP)并经腹主动脉取血. 常规HE染色和Van Gieson(VG)胶原染色, 检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CIV)和羟脯氨酸(Hyp). 应用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、Ⅰ型胶原纤维(COLⅠ)、Ⅲ型胶原纤维(COL Ⅲ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA的表达. 应用Western blot或明胶酶谱法检测TIMP-2、α-SMA和MMP-2蛋白的表达.

结果: 各治疗组在应用抗TIMP-2 siRNA治疗后组织学病变减轻, PVP较模型组降低(2.2±0.1, 1.9±0.1, 1.6±0.1 kPa vs 2.7±0.1 kPa, P<0.05), 血清ALT和AST减少(2089.3±154.5, 1869.8±138.0, 1422.5±139.7 nkat/L vs 2717.2±193.8 nkat/L, P<0.05; 3634.1±242.7, 2739.4±141.3, 2286.6±145.5 nkat/L vs 4067.5±251.5 nkat/L, P<0.05), 反映肝纤维化指标的HA, LN, PCⅢ, CIV和Hyp均显著低于模型组(176.0±10.2, 160.6±9.3, 109.9±9.4 μg/L vs 206.3±17.0 μg/L, P<0.05; 93.1±8.2, 71.4±7.5, 55.9±7.3 μg/L vs 116.6±10.8 μg/L, P<0.05; 71.2±6.1, 64.1±5.1, 53.6±4.3 μg/L vs 91.2±8.9 μg/L, P<0.05; 64.3±5.4, 50.7±5.8, 41.6±4.4 μg/L vs 80.3±6.8 μg/L, P<0.05; 328.7±17.6, 279.7±16.3, 230.4±16.1 μg/g vs 380.7±20.6 μg/g, P<0.05). 各治疗组TIMP-2, COLⅠ, COL Ⅲ和α-SMA mRNA的表达较模型组明显减少(7.53±0.83, 5.04±0.75, 1.30±0.49 vs 23.23±2.14, P<0.05; 33.38±2.85, 22.80±2.48, 11.45±1.27 vs 43.18±3.32, P<0.05; 19.23±1.95, 13.21±1.35, 10.11±1.09 vs 25.90±2.23, P<0.05; 23.76±2.06, 15.33±1.25, 10.53±1.02 vs 34.85±3.16, P<0.05), 且TIMP-2, MMP-2和α-SMA蛋白的表达也相应减少(23.27±3.06, 14.13±1.86, 9.16±1.33 vs 44.83±5.45, P<0.05; 23.80±2.14, 15.58±1.52, 9.52±0.93 vs 39.90±3.23, P<0.05; 24.58±2.59, 19.29±2.31, 13.40±1.98 vs 57.19±7.07, P<0.05).

结论: 化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能显著降低TIMP-2的表达, 促进细胞外基质的降解, 抑制肝星状细胞的活化.

Keywords: 金属蛋白酶组织抑制剂-2; 小干扰RNA; 肝纤维化; 基因治疗