基础研究
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世界华人消化杂志. 2006-08-18; 14(23): 2288-2293
Published online 2006-08-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i23.2288
原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响
邓欢, 刘亮明, 张吉翔, 罗杰, 尹东, 熊瑛, 汤蕾, 谢正元
邓欢, 刘亮明, 张吉翔, 罗杰, 熊瑛, 汤蕾, 谢正元, 南昌大学第二附属医院消化内科 江西省分子医学重点实验室 江西省南昌市 330006
尹东, 江西省分子医学重点实验室 江西省南昌市 330006
邓欢, 2004年南昌大学医学院本科毕业, 现为南昌大学第二附属医院2004级在读硕士研究生, 主要从事消化系肿瘤基因治疗的基础和临床研究.
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. 30160032, No. 30360037; 江西省科委重点项目, No. 200110300101, No. 20041B0300300.
通讯作者: 张吉翔, 330006, 江西省南昌市民德路1号, 南昌大学第二附属医院消化内科、江西省分子医学重点实验室. jixiangz@tom.com
电话: 0791-6292706 传真: 0791-6262262
收稿日期: 2006-05-30
修回日期: 2006-06-18
接受日期: 2006-06-24
在线出版日期: 2006-08-18
Abstract

目的: 克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3, 观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响.

方法: 利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA, 采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA, 并构建重组质粒pEGFP-N2/pim-3, 转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株, 酶切以及测序鉴定. 将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况, 并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测.

结果: 将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收, 在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带, 与实验设计符合; 阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明, 大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2/pim-3的构建成功; 重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3.5%, 质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10.7%, 而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11.0%, 重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0.05); 倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-7721细胞中的正常表达; MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡.

结论: 真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功; 原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡.

Keywords: 肝癌; 原癌基因pim-3; 克隆; 凋亡; 荧光显微镜; MTT比色试验; 流式细胞术