基础研究
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世界华人消化杂志. 2006-06-18; 14(17): 1654-1661
Published online 2006-06-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i17.1654
RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达
肖斌, 施瑞华, 杜琰萍, 朱宏, 凌亭生, 张国新, 林艳, 郝波
肖斌, 施瑞华, 杜琰萍, 朱宏, 凌亭生, 张国新, 林艳, 郝波, 南京医科大学第一附属医院消化科 江苏省南京市 210029
肖斌, 1997年南京医科大学本科毕业, 主治医师, 硕士在读, 主要从事消化系统疾病的临床与基础研究.
基金项目: 江苏省自然科学基金资助项目, No. BK2005153.
通讯作者: 施瑞华, 210029, 江苏省南京市广州路300号, 南京医科大学第一附属医院消化科. ruihuashi@126.com
电话: 025-83718836-6973
收稿日期: 2006-03-24
修回日期: 2006-04-10
接受日期: 2006-05-09
在线出版日期: 2006-06-18
Abstract

目的: 观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中HIF-1α基因的沉默效应, 筛选有效干扰靶点.

方法: 设计合成干扰缺氧诱导因子-1α RNA寡核苷酸片段, 经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上, 测序鉴定. 应用LipofectamineTM 2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞, 其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选. 荧光显微镜评估转染效率, 荧光定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达情况, Western blot检测HIF-1α蛋白表达情况.

结果: 成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsi-H1-shHIF, 293T细胞平均转染效率为约85.4%, Eca-109细胞的平均转染效率约73.2%. 荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降, 其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显. 在瞬时转染72 h后的293T细胞中, 其抑制率分别达到了78.5%、86.9% (P = 0.000, P = 0.000 vs 72 h空白对照组), 筛选2 wk的Eca-109细胞中, 3号靶点对HIF-1α mRNA的抑制率也达到了69.7% (P = 0.000 vs 2 wk空白对照组).

结论: 重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达, 经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位.

Keywords: 食管鳞癌; 缺氧诱导因子-1α; RNA干扰; 短发夹状RNA