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世界华人消化杂志. 2006-05-28; 14(15): 1453-1457
Published online 2006-05-28. doi: 10.11569/wcjd.v14.i15.1453
Published online 2006-05-28. doi: 10.11569/wcjd.v14.i15.1453
胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定
高利利, 吴本俨, 王孟薇, 黄海力, 伍银桥, 尤纬缔, 王卫华, 解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
高利利, 2005年首都医科大学博士毕业, 主治医师, 主要从事消化道肿瘤和动力的临床及基础研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 , No. 30370635 .
通讯作者: 吴本俨, 100853, 北京市复兴路28号, 解放军总医院南楼消化科.
电话: 010-66939443
收稿日期: 2006-02-13
修回日期: 2006-03-16
接受日期: 2006-03-20
在线出版日期: 2006-05-28
修回日期: 2006-03-16
接受日期: 2006-03-20
在线出版日期: 2006-05-28
Abstract
目的: 构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体.
方法: 从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段, 两端分别引入限制性内切酶KpnI, BamHI和EcoRI, BamHI识别位点, 按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+). 测序正确的重组子pcDNA3.1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3.1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株, 采用半定量RT-PCR及Western blot比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异.
结果: 经测序证实, GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3.1(+), 组成重组子pcDNA3.1-a(含正向克隆), pcDNA3.1-b(含反向克隆). 重组子pcDNA3.1-a, pcDNA3.1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株. 与对应的空载体比较, RT-PCR结果显示转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中其mRNA的表达上调35.4%, 而转染pcDNA3.1-b的MKN45细胞中其mRNA的表达下调32.1%; Western blot结果显示转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49.4%, 而转染pcDNA3.1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50.3%.
结论: 成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体.
Keywords: 胃癌相关基因GCRG213; 真核表达; 胃癌细胞; 基因转染