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世界华人消化杂志. 2006-05-18; 14(14): 1357-1361
Published online 2006-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i14.1357
Published online 2006-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i14.1357
人自身抗原CYP2D6 285 bp基因片段克隆、真核表达及免疫性鉴定
王文凯, 李永哲, 中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院检验科 北京市 100730
刘国振, 中国科学院北京华大基因研究中心 北京市 101300
王文凯, 2003年北华大学医学院硕士研究生, 主要从事自身免疫性疾病研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 , No. 30471617 ; 国家863计划重大专项基金资助项目 , No. 2002AARZ2011 .
通讯作者: 李永哲, 100730, 北京市, 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科. yongzhelipumch@yahoo.com.cn
电话: 010-65295416 传真: 010-65295416
收稿日期: 2006-01-11
修回日期: 2006-02-19
接受日期: 2006-02-21
在线出版日期: 2006-05-18
修回日期: 2006-02-19
接受日期: 2006-02-21
在线出版日期: 2006-05-18
Abstract
目的: 真核表达人自身抗原细胞色素P450 2D6(CYP2D6)显性表位285 bp基因片段, 获得具免疫学活性的纯化重组蛋白, 为自身免疫性肝炎抗体的检测提供特异性抗原.
方法: 以肝脏的cDNA混合文库为模板作PCR, 将PCR产物与真核表达载体pEGH共同转化酿酒酵母Y258, 碱裂解法进行质粒制备, PCR扩增鉴定. 表达载体构建成功后, 在半乳糖的诱导下表达产生重组融合蛋白, 利用GST亲和层析法进行纯化. 然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(WB)及蛋白质质谱学(MALDI-TOF)检测.
结果: PCR产物约290 bp, 与预期285 bp接近. pEGH-CYP2D6重组阳性克隆PCR鉴定与预期大小接近, SDS-PAGE和WB结果显示, 融合蛋白Mr37 000, 具有天然人自身抗原CYP2D6的免疫原性. 质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对, 与CYP2D6蛋白同源性最高.
结论: 成功克隆表达人自身抗原CYP2D6的显性表位, 为建立新的自身免疫性肝炎抗体检测方法奠定了基础.
Keywords: 自身抗原; 融合基因; 细胞色素P450 2D6; 显性表位