修回日期: 2005-02-28
接受日期: 2005-03-03
在线出版日期: 2005-05-01
目的: 克隆与肿瘤恶性演进相关但未知功能的新基因MGC39325, 构建其真核表达载体, 并应用生物信息学初步探讨其功能.
方法: 应用RT-PCR技术从LoVo细胞中扩增MGC39325基因全长ORF, 选用pGEM-T载体进行TA克隆, 再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)的启动子和终止子之间, 通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定. 应用生物信息学初步分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能.
结果: 从LoVo细胞中扩增出1 158 bp的cDNA, 成功进行TA克隆并进一步亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体, 测序证实为人MGC39325基因. 生物信息学分析显示此基因定位于8q12.1, 含有2个外显子(1 113 bp), DNA序列含有表皮样生长因子位点标记(3-14, 12-23)、整合素beta链半胱氨酸富集区位点标记(183-196)、铁氧化还原蛋白铁硫结合区位点标记(389-397, 1027-1038)、第Ⅷ因子结构域位点标记(105-157, 548-591)、羧基端胱氨酸结位点标记(744-782)等, 编码由370个氨基酸组成蛋白质, Mr 40 727.9, pI值为9.45, 疏水性平均值为-0.668, 含3个低复杂性区域结构, 氨基酸序列含有豆蔻酰化位点(19-24, 130-135)、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶(38-41, 46-49, 204-207)、酪蛋白激酶(49-52, 158-161)、酪氨酸激酶(53-61)、蛋白激酶C磷酸化位点(97-99, 140-142, 208-210)、N-糖基化位点(97-99)等结构域, 提示这一新的蛋白质可能在细胞生长、黏附及细胞信号转导方面具有重要功能.
结论: 成功地克隆了人MGC39325基因全长ORF, 构建了其pcDNA3.1(+)真核表达载体, 为进一步研究其功能及其肿瘤中的作用创造了条件.