基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-04-15; 13(8): 975-978
Published online 2005-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i8.975
可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox的构建与表达
陈耀凯, 李俊刚, 王宇明
陈耀凯, 李俊刚, 王宇明, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
陈耀凯, 男, 1966-12-27生, 河南省固始县人, 汉族. 1998年华中科技大学工学博士, 副教授, 副主任医师.
基金项目: 国家自然科学基金资助, No. 30100080.
通讯作者: 陈耀凯, 400038, 重庆市沙坪坝区高滩岩正街29号, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. yaokaichen@hotmail.com
电话: 023-68754475-8006 传真: 023-65461319
收稿日期: 2005-01-28
修回日期: 2005-02-11
接受日期: 2005-02-16
在线出版日期: 2005-04-15
Abstract

目的: 为建立可回复性永生化肝细胞株, 构建带有筛选基因NeoR、报道基因EGFP及重组位点loxP的可回复性永生化逆转录病毒载体.

方法: 将2.1 kb SV40T亚克隆到pIRES2-EGFP的相应位点, 再酶切下3.4 kb SV40T-IRES-EGFP片段插入逆转录病毒载体pLNCX2的两个相同酶切位点之间, 构成新载体pLNCTIG. 最后, 将线性化pLNCTIG和loxP双链片段混合连接. 取连接产物转化高效感受态DH5α细胞. 菌落PCR和酶切法鉴定阳性克隆. 转染包装细胞PT67并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达. 扩大培养稳定转染的细胞, 免疫组化染色检测SV40T基因的表达.

结果: 随机挑取19个克隆, 3个电泳分离出约1.1 kb阳性条带. 取上述阳性克隆进行酶切鉴定, 结果仅出现一条约9.5 kb的条带, 证明该克隆为阳性重组体. 转染PT67细胞24 h后, 荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光. 免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色.

结论: 成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox.

Keywords: 可回复性永生化; 肝细胞; pLNCTIGlox