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世界华人消化杂志. 2005-10-28; 13(20): 2431-2436
Published online 2005-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i20.2431
Published online 2005-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i20.2431
PolⅡ-ChIP-PE-MS方法的建立及其在SNP功能研究中的应用
晏泽辉, 邓国宏, 王宇明, 第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
晏泽辉, 男, 1978-12-16生, 湖北省罗田县人, 汉族, 2003年第三军医大学西南医院硕士生, 医师.
基金项目: 国家自然科学基金资助 , No. 30470964 .
通讯作者: 王宇明, 400038, 重庆市, 第三军医大学西南医院全军感染病研究所. wym417@mail.tmmu.com.cn
电话: 023-68754141
收稿日期: 2005-08-29
修回日期: 2005-09-01
接受日期: 2005-09-06
在线出版日期: 2005-10-28
修回日期: 2005-09-01
接受日期: 2005-09-06
在线出版日期: 2005-10-28
Abstract
目的: 建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS), 并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量, 为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.
方法: 采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型, 利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀, 针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物, 以外侧引物进行PCR扩增, 采用延伸引物进行VLET引物延伸, 产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.
结果: 对SNRPN杂合子细胞的SNRPN C1654312T SNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现, 基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量, 但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合, 与产生mRNA转录的等位点相对应.
结论: 成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法, 利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的, 可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.
Keywords: 单核苷酸多态性; RNA多聚酶Ⅱ; 染色质免疫沉淀; 引物延伸; 质谱