Published online 2005-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i20.2413
修回日期: 2005-09-01
接受日期: 2005-09-06
在线出版日期: 2005-10-28
目的: 构建含人CD40 ligand(CD40L)基因的真核表达载体, 并使之在人肝癌细胞HepG2中表达, 研究CD40L稳定表达对HepG2细胞的影响.
方法: 从人外周血单个核细胞总RNA中经RT-PCR扩增出人CD40L基因, 经过酶切连接进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A制备重组质粒. 重组质粒经酶切及测序证实人CD40L基因成功克隆进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A, 并进一步转入大肠杆菌(E.coli DH5α)大量扩增. 实验分4组, A组HepG2细胞转染重组质粒, B组HepG2细胞转染不含CD40L cDNA的空质粒, C组HepG2细胞正常培养, D组HepG2细胞加入G418作为转染对照. RT-PCR及流式细胞术鉴定A, B, C 3组细胞表面CD40L和CD40的表达后, A, B, C 3组细胞分别设6个复孔培养72 h后, 流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达.
结果: 测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功. 流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7%, CD40表达为15.4%; B和C组细胞表面仅有CD40表达, 分别为31.7%和28.5%. A组细胞凋亡率45.0±0.3%, B, C组均未发生明显凋亡(P<0.01). 与C组细胞比较, A组细胞周期分布主要阻滞在G1期(90.4±1.3% vs 60.6±1.5%, P<0.01), S期(6.32±1.0% vs 12.0±0.7%)和G2/M期分布(3.3±0.7% vs 27.3±1.2%)均有减少(P<0.01). A组细胞Fas表达率(27.8±1.5%)较B组(3.2±0.8%)和C组(4.2±1.0%)明显上调(P<0.01).
结论: 我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达, CD40L对于HepG2细胞具有促凋亡的作用, 这可能与CD40L-CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调和细胞周期阻滞有关.